香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制

詹海濤， 李海燕， 曾煦欣， 吳劍峰

香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制

詹海濤， 李海燕， 曾煦欣， 吳劍峰

目的 探討香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制。方法

SD大鼠隨機(jī)分4組:假手術(shù)組、模型組及治療A、B組。雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ25～35建立擬AD大鼠模型，治療組按設(shè)定方式給藥，假手術(shù)組、模型組給1%吐溫溶液。給藥28d，Morris水迷宮方法測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，定量分析海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、SOD活力顯著降低，AchE活力、MDA含量顯著增高(P＜0.01)。與模型組比較，治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、SOD活力顯著增高，AchE活力、MDA含量顯著降低(P＜0.05，或P＜0.01)。結(jié)論 香港遠(yuǎn)志乙酸乙酯提取物，可有效改善擬AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，作用機(jī)制可能與降低AchE活力、調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)平衡;降低MDA含量、增強(qiáng)SOD活力，減少氧自由基產(chǎn)生，緩解氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

香港遠(yuǎn)志提取物; 阿爾茨海默病; 乙酰膽堿酯酶; 超氧化物歧化酶; 丙二醛

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進(jìn)行性記憶障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其逐年增高的發(fā)病率，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的社會(huì)問(wèn)題。目前，臨床治療AD仍缺乏理想的方法和藥物。本研究采用β－淀粉樣多肽25～35片斷(Aβ25～35)誘導(dǎo)擬AD模型大鼠，觀察香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)大鼠行為學(xué)、腦組織中乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量的影響，探討香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD模型大鼠的治療作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 雄性健康SD大鼠40只，體重250～280g(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分4組:假手術(shù)組、模型組、香港遠(yuǎn)志提取物治療A組及B組，每組10只。

1.1.2 香港遠(yuǎn)志提取物分離 香港遠(yuǎn)志全草，粉碎后用70%MeOH 65 L回流提取1.5h，共3次。合并提取液，減壓回收溶劑，得浸膏懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取得提取物(100g全草萃取1g提取物)。

1.1.3 試劑及儀器 Aβ25～35(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，AchE、SOD、MDA試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)，DYT2E型大鼠腦立體定位儀(購(gòu)于中國(guó)天津醫(yī)療器械研究所)，756型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(購(gòu)于上海光譜儀器有限公司)，全自動(dòng)Morris水迷宮及視頻分析軟件(購(gòu)于上海吉量軟件科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制備及給藥 用無(wú)菌生理鹽水將Aβ25～35稀釋成10μg/μl，37℃ 孵育72h，使其呈聚集狀，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩８骨蛔⑸?0%水合氯醛(3ml/kg)麻醉大鼠，固定在腦立體定位儀，根據(jù)腦立體圖譜，定位雙側(cè)海馬CA1區(qū)，用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，用微型進(jìn)樣器分別于模型組、治療組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)緩慢(6min內(nèi))注入Aβ25～35各1μl(10μg)，留針8min。假手術(shù)組以相同方式注射等量生理鹽水，皮膚切口用青霉素粉劑消炎，縫合皮膚。AD模型制備后3d，治療 A組、B組分別以50mg/kg/d及100mg/kg/d劑量灌胃給藥28d，(每天1次，用時(shí)將香港遠(yuǎn)志提取物以1%吐溫溶液配成所需濃度)。假手術(shù)組、模型組給等量1%吐溫溶液。各組大鼠室溫(23～25℃)下自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 給藥28d后，應(yīng)用Morris水迷宮行為學(xué)方法［1］測(cè)定各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。由大鼠入水后搜索及爬上平臺(tái)所需的時(shí)間確定逃避潛伏期(單位:s)。如在1min內(nèi)大鼠找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)，其逃避潛伏期為1min，在1min內(nèi)找到平臺(tái)的大鼠，按實(shí)際時(shí)間確定其逃避潛伏期。

1.2.3 腦組織AchE、SOD、MDA測(cè)定 完成學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定后，以頸椎脫臼法處死各組大鼠，斷頭取腦，分離出海馬及周?chē)M織，用冰冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，稱(chēng)重，將剪碎的腦組織塊倒入勻漿器中，用冰冷生理鹽水配制成10%腦組織勻漿。按AchE、SOD、MDA試劑盒的操作要求，用比色法測(cè)定。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的平均逃避潛伏期，均隨測(cè)試日期延伸而漸縮短。與假手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)記錄的1、2、3d，模型組的平均逃避潛伏期均顯著增長(zhǎng)(P＜0.01);與模型組比較，治療組各時(shí)間點(diǎn)的平均逃避潛伏期顯著縮短(A組:P＜0.05，B組:P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 腦組織AchE、SOD、MDA測(cè)定 與假手術(shù)組比較，模型組AchE活力、MDA含量顯著增高，SOD活力顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，治療組AchE活力顯著降低(B組:P＜0.05)、MDA含量顯著降低(A組:P＜0.05，B組:P＜0.01)、SOD活力顯著增高(A組:P＜0.05，B組:P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD模型大鼠水迷宮逃逸潛伏期的影響(±s，t/s)

表1 香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD模型大鼠水迷宮逃逸潛伏期的影響(±s，t/s)

與假手術(shù)組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n 1d 2d 3d假手術(shù)組模型組治療A組治療B組10 10 10 10 21.96±9.81 46.78±14.37* 33.12±12.97△25.26±10.13△△13.25±6.15 37.69±13.49* 26.14±10.54△20.51±9.14△△11.62±5.97 30.84±12.31* 20.73±8.29△14.17±7.31△△

表2 香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD模型大鼠腦組織AchE、SOD、MDA的影響(±s)

表2 香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD模型大鼠腦組織AchE、SOD、MDA的影響(±s)

與假手術(shù)組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n AchE(u/mg) SOD(u/mg) MDA(nmol/mg)假手術(shù)組模型組治療A組治療B組10 10 10 10 0.38±0.13 0.77±0.31* 0.53±0.24 0.49±0.21△127.95±8.43 79.76±5.74* 85.45±6.16△90.61±7.05△△3.61±0.44 8.15±0.87* 7.58±0.61△7.14±0.59△△

3 討論

由于AD的病因、發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，臨床缺乏理想的防治措施，因此，在探究AD病因、發(fā)病機(jī)制并不斷闡明新的分子作用靶點(diǎn)基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)療效確切的防治藥物，仍需大量深入的藥物篩選、藥效和作用機(jī)制研究。在此領(lǐng)域，中藥因成本低、分子作用靶點(diǎn)廣、毒副作用少等優(yōu)勢(shì)［2］，具獨(dú)特的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。遠(yuǎn)志屬的多種植物在文獻(xiàn)古籍中具有安神益智作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有提高學(xué)習(xí)記憶力、腦保護(hù)和抗癡呆作用。香港遠(yuǎn)志(Polygala hongkongensis Hemsl)系遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬植物，民間以全草入藥，具有活血、化瘀、解毒之功效［3］，新近的體外研究證實(shí)其具有抗氧化作用［4，5］。本研究首次選用香港遠(yuǎn)志乙酸乙酯提取物，探究其對(duì)擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的治療作用及作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)防治AD新藥提供研究資料。

AD早期的病理改變是Aβ在腦內(nèi)沉積，海馬結(jié)構(gòu)是AD最早、最易受損的部位［6］。研究證實(shí)，腦內(nèi)注射Aβ可使動(dòng)物產(chǎn)生擬AD的記憶缺損癥狀［7］，本研究采用大鼠雙側(cè)海馬注射聚集狀A(yù)β25～35，擬腦內(nèi)Aβ沉積，建立AD大鼠模型。應(yīng)用Morris水迷宮行為學(xué)方法，測(cè)定各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果表明，模型組的平均逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著增長(zhǎng)，提示大鼠出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。與模型組比較，治療組的平均逃避潛伏期隨藥物劑量的增大而顯著縮短，提示香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)擬AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，有良好的改善作用。

中樞膽堿能系統(tǒng)是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能的主要通路，研究顯示，ACh是通過(guò)膈區(qū)－海馬－邊緣葉和大腦皮質(zhì)兩條通路，發(fā)揮特異性調(diào)節(jié)第一級(jí)記憶轉(zhuǎn)入第二級(jí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)［8］。AchE是ACh的降解酶，其主要生理功能是水解ACh生成膽堿和乙酸，終止膽堿能突觸間的脈沖傳遞，維持膽堿能系統(tǒng)功能的平衡。膽堿能神經(jīng)元退化、ACh含量不足、AchE活性升高導(dǎo)致的該系統(tǒng)功能紊亂，是AD的重要發(fā)病機(jī)制之一。由于目前仍難于準(zhǔn)確測(cè)定ACh含量，許多研究應(yīng)用AchE活性測(cè)定間接反映ACh代謝情況。本研究結(jié)果顯示，模型組AchE活力較假手術(shù)組顯著增高，表明擬AD大鼠出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶障礙與海馬區(qū)AchE活力增高有關(guān)。與模型組比較，治療組AchE活力，隨藥物劑量的增大顯著降低，表明香港遠(yuǎn)志提取物改善擬AD大鼠認(rèn)知和記憶障礙的作用機(jī)制，可能與降低AchE活力、調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)平衡、恢復(fù)其生理功能有關(guān)。

研究表明，Aβ可能因其本身既是氧自由基供體或誘導(dǎo)生成活性氧發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［9］從而導(dǎo)致體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的生理平衡紊亂。腦組織對(duì)氧的高度依賴(lài)性及富含不飽和脂肪酸，使其成為最易遭受自由基毒性作用的部位。自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化作用，主要損傷灰質(zhì)神經(jīng)元，抑制甚至喪失蛋白的生理性功能，導(dǎo)致細(xì)胞變性、死亡。SOD是機(jī)體清除自由基的關(guān)鍵酶，其抗氧化功能在防御自由基的損傷中發(fā)揮重要作用。脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物是MDA，測(cè)定其含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映組織細(xì)胞的受損程度［10］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量顯著增高，SOD活力顯著降低，表明氧化應(yīng)激參與了擬AD的形成過(guò)程，大鼠出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶障礙，與其體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的平衡紊亂有關(guān)。與模型組比較，治療組隨藥物劑量的增大，MDA含量顯著降低、SOD活力顯著增高，提示香港遠(yuǎn)志提取物，通過(guò)恢復(fù)機(jī)體氧化還原體系平衡，提高機(jī)體抗氧化能力，改善擬AD大鼠的認(rèn)知和記憶功能障礙。

本研究結(jié)果表明，香港遠(yuǎn)志乙酸乙酯提取物，可有效改善擬AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，其作用機(jī)制可能與降低AchE活力、調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)平衡;增強(qiáng)SOD活力、降低MDA含量，恢復(fù)氧化還原體系平衡，提高機(jī)體抗氧化能力等有關(guān)。進(jìn)一步明確其調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)與氧化還原體系的內(nèi)在關(guān)系，有待今后深入研究。

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Effect and mechanism of polygala hongkongensis hemsl extracts on learning and memory in Alzheimer’s disease model rats

ZHAN Hai－tao，LI Hai－yan，ZENG Xi－xin，et al.(Medical College of Foshan University，F(xiàn)oshan528000，China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of polygala hongkongensis hemsl extracts(PHHE)on learning and memory in Alzheimer’s disease(AD)model rats.MethodSD rats were randomly divided into 4 groups，sham operated group，model group and treatment group A and B.The amyloid－β25～35 was injected into the hippocampus to induce AD models.Treatment groups

drug respectively according to grouping protocol，while the sham operated group and model group received 1%tween－80 solution.After 28 days with PHHE intervention，the learning and memory abilities were measured by water maze，and the AchE，SOD and MDA in the hippocampus region were quantified.ResultsCompared with sham operated group，the learning and memory abilities and the activity of SOD were obviously decreased，the activity of AchE and MDA were obviously increased in model group(P＜0.01).Compared with model group，the learning and memory abilities and the activity of SOD were obviously increased，the activity of AchE and MDA was obviously decreased in treatment groups(P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionPHHE can effectively improve the ability of learning and memory in AD model rats，which may be achieved by inhibiting the activity of AchE，promoting the restore of choline nervous system function，reducing the quantity of MDA，increasing the activity of SOD，reducing toxic free radical and relaxing oxidative injury.

Polygala hongkongensis hemsl extracts;Alzheimer’s disease;Acetylcholinesterase;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R749.1+6

A

1003－2754(2012)03－0243－03

2011－11－16;

2012－01－18

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151064201000042)

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東佛山528000)

吳劍峰，E－mail:jianfeng839@sina.com