乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白促進HepG2細胞遷移并調節β－catenin表達*

崔利園， 張釗瑞， 費洪榮， 姚樹桐， 李曉倩， 王鳳澤△

(泰山醫學院1生物科學學院，2藥學院，3基礎醫學院，山東 泰安271016)

原發性肝細胞癌是我國常見的高發性惡性腫瘤之一，其發生轉移和侵襲是術后復發和導致患者死亡的主要原因［1-2］。乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein，HBXIP)由于能夠與乙肝病毒 X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的C末端結合而被命名，其在腫瘤組織中高表達，參與調控乙肝病毒的復制、細胞增殖、細胞凋亡及有絲分裂等生命過程［3-5］。本實驗旨在研究HBXIP與肝細胞癌轉移的相關性，并對其作用機制進行初步探討，為臨床上有效地治療肝細胞癌提供理論指導。

材料和方法

1 主要材料

人肝癌細胞系HepG2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;穩定高表達HBXIP的HepG2細胞系由本室保存［5］。RPMI-1640培養基和胎牛血清購于Gibco;Transwell小室購自BD;明膠購自Sigma;G418購自Merck;ECL顯色試劑盒購自Pierce;β-actin抗體購自Sigma;基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)抗體購自Santa Cruz;磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β)(Thr216)抗體購自 BD;β -連環蛋白(β-catenin)抗體、p-β-catenin(Thr41/Ser45)抗體和p-GSK-3β(Ser9)抗體購自Cell Signaling;兔抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司。

2 方法

2.1 細胞培養 HepG2細胞用RPMI-1640培養基，含有10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1硫酸鏈霉素，37℃、5%CO2條件下孵箱培養。

2.2 細胞遷移實驗 細胞無血清培養24 h后，胰酶消化并計數。將Transwell小室(8.0 μm聚碳酸酯微孔膜)放入24孔培養板中，上室加入適量細胞，用含0.1% 胎牛血清的培養基培養，下室培養基含2.5 mg/L的纖維黏連蛋白。37℃培養24 h后，取出微孔膜并用90% 乙醇固定15 min，棄去固定液，然后用棉球擦去膜上層細胞，臺盼藍染色后計數膜下層附著的細胞數。實驗重復3次。

2.3 明膠酶譜分析法檢測MMP-9的酶活性 無血清培養液處理細胞24 h后收集培養液并于4℃離心10 min(12 000 r/min)，0.22 μm濾器過濾制備成條件培養上清液，測定蛋白總量并進行酶譜分析。將條件培養液與不含還原劑的上樣緩沖液混勻上樣于含1 g/L明膠的SDS-PAGE，然后進行電泳。電泳結束后將膠體置于洗脫液(含2.5%Triton X-100)中輕搖洗滌;然后放置于明膠緩沖液中37℃孵育30 h，接著加入考馬斯亮藍溶液染色2 h后，加入脫色液脫色至藍色背景上顯現負染條帶。凝膠中由于含有底物蛋白而染色較深，在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解底物蛋白而不被染色，進而形成透明區域(負染)，MMP-9的酶活性與負染條帶的透明度與范圍呈正相關。

2.4 免疫印跡分析 細胞用預冷的PBS洗2次后加入細胞裂解液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol·L-1EDTA，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L-1PMSF，1%SDS，protease inhibitor cocktails)，冰上放置20 min后4℃13 000×g離心20 min，收集上清定量分析。取40μg總蛋白進行SDS-PAGE實驗，接著電轉移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉過夜，然后分別與MMP-9抗體(1∶300)、β-catenin抗體(1∶800)、p-β -catenin(Thr41/Ser45)抗體(1∶500)、p-GSK-3β(Ser9)抗體(1∶1 000)和 p-GSK-3β(Thr 216)抗體(1∶400)室溫孵育3 h;PBST洗膜3次，每次10 min;接著分別加入相應的兔抗小鼠IgG(1∶4 000)和山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育 1.5 h，PBST洗膜 3次，每次 10 min;最后用 ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。以β-actin作為內參照，實驗重復3次。

3 統計學處理

結 果

1 Transwell法檢測HBXIP對HepG2肝癌細胞遷移的影響

鏡下計數Transwell小室濾膜下的細胞數，結果如圖1所示。遷移24 h后臺盼藍染色發現，HBXIP高表達組(HepG2-HBXIP)細胞數量明顯多于空載體對照組細胞(pCMV-tag2B)(P＜0.05)，表明 HBXIP的高水平表達可明顯促進HepG2細胞的遷移。

Figure 1.Overexpression of HBXIP enhanced HepG2 cell migration(trypan blue staining，×100).±s.n=6.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖1 HBXIP對HepG2細胞遷移的誘導作用

2 HBXIP對MMP－9活性及表達的影響

HBXIP 可明顯上調MMP-9的活性，見圖2;HBXIP同時上調HepG2細胞中MMP-9蛋白表達水平，見圖3。

3 HBXIP 對β－catenin及GSK－3β表達水平的影響

HBXIP可促進HepG2細胞中β-catenin的表達，并抑制β-catenin的磷酸化，從而有利于 β-catenin的穩定性。HBXIP抑制GSK-3β絲氨酸磷酸化，而促進其蘇氨酸的磷酸化形式，見圖4。

Figure 2.Activity of MMP-9 in HepG2 cells induced by HBXIP.圖2 明膠酶譜法檢測HBXIP對MMP－9活性的影響

Figure 3.Overexpression of MMP-9 induced by HBXIP in HepG2 cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖3 免疫印跡檢測HBXIP對MMP－9表達水平的影響

討 論

HBXIP基因由Melegari等［3］于1998年首次從 HepG2細胞中克隆獲得。作為HBx的結合蛋白，HBXIP能特異地結合HBx的C末端，通過降低HBx活性而改變乙型肝炎病毒的復制周期;HBXIP還能與生存素(survivin)形成復合物并結合pro-caspase-9，使survivin通過細胞色素C介導的凋亡途徑抑制細胞凋亡。我們前期的研究結果顯示，HBXIP對肝癌細胞的增殖具有促進作用，且在肝癌組織中高表達［6］，因此推測HBXIP與肝癌的發生發展密切相關。

本研究以HepG2細胞為實驗材料，在建立穩定高表達HBXIP蛋白細胞系的基礎上，初步探討了HBXIP與肝細胞癌遷移的相關性及可能的分子機制。實驗結果表明，HBXIP的高水平表達促進了HepG2細胞的遷移能力，增強了細胞中MMP-9的活性。MMPs是以Ca2+、Zn2+等金屬離子為輔助因子的蛋白質，與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解關系密切［7］。根據作用底物以及片段同源性，將MMPs分為:膠原酶、明膠酶(IV型膠原酶)、基質溶酶等幾大類。明膠酶為其中重要的一類，主要有2種形式:分子量為92 kD的MMP-9和分子量為72 kD的MMP-2，兩者均與多種腫瘤的侵襲轉移密切相關［8-9］。MMP-9在腫瘤組織中以活性形式(81 kD)和非活性形式pro-MMP-9(92 kD)2種形式存在，由于在病理生理過程中起作用的主要是活化型MMPs，因此本研究主要通過明膠酶譜實驗檢測HepG2細胞中MMP-9的活性形式。

β-catenin是經典Wnt信號通路的下游因子，與腫瘤的增殖、遷移侵襲及凋亡均相關，其表達水平的升高是Wnt信號通路致癌的關鍵［10］。免疫印跡結果表明，HBXIP參與調節β-catenin的表達，HBXIP的高表達抑制了β-catenin的磷酸化，從而有利于保持細胞內β-catenin蛋白的穩定性，激活相關基因的轉錄。GSK-3β是一種蛋白激酶，其不同的磷酸化方式(絲氨酸/蘇氨酸)對其催化活性有著不同的影響［11-13］。當HBXIP在肝癌細胞中的高水平表達時，促進了GSK-3β上Ser9的磷酸化而抑制了其Thr216的磷酸化。GSK-3β的Ser9磷酸化對GSK-3β的活性起抑制作用，而Thr216的磷酸化則激活GSK-3β的活性，因此HBXIP能夠通過抑制GSK-3β的激酶活性來增加β-catenin的穩定性。

綜上所述，HBXIP具有促進肝癌細胞遷移的作用，其分子機制可能與HBXIP調節MMP-9的活性及β-catenin的穩定表達有關。

Figure 4.HBXIP increased β -catenin level and inhibited the phosphorylation of β -catenin by regulating the phosphorylation of GSK-3β.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖4 免疫印跡檢測 HepG2細胞中β－catenin、p－β－catenin和p－GSK－3β表達水平

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