遠志皂苷元對氧化應激損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用*

別 曼， 徐 穎， 胡慧玲， 逯 丹， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥△

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，暨南大學腦科學研究所，國家中藥管理局三級科研實驗室，2暨南大學－香港大學腦功能與健康聯(lián)合實驗室，廣東廣州510632;3中山大學中山眼科中心，廣東廣州510060)

視神經(jīng)損傷是眼科和神經(jīng)科的常見疾病，也是致盲的主要原因之一，病因涉及諸多因素。研究表明，外傷、青光眼［1］、缺血［2］及神經(jīng)軸突損傷等［3－4］因素造成的視神經(jīng)損傷，能夠引發(fā)視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)內氧化應激的發(fā)生，從而導致RGCs原發(fā)或(和)繼發(fā)性死亡，且死亡形式主要為細胞凋亡。

抗氧化的藥物目前有多種，如中藥類、維生素類及多糖類等。在中藥類藥物中，單體遠志皂苷元(senegenin，Sen)在改善學習與記憶能力［5］、抗衰老［6］及抗氧化等［7］方面有顯著作用。本教研室的前期研究發(fā)現(xiàn)，遠志皂苷元具有抑制Aβ25－35誘導的PC12細胞凋亡，并且對缺氧/復氧損傷的PC12細胞，遠志皂苷元也表現(xiàn)出一定的保護作用。然而遠志皂苷元對氧化應激損傷的RGCs有何影響尚不清楚。本研究選取遠志皂苷元作用于發(fā)生氧化應激損傷的RGCs，觀察其是否對損傷的RGCs有保護作用，并初步探討其作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 出生3～5 d的SPF級Sprague－Dawley(SD)乳鼠，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供。動物合格證編號為SCXK(粵)2006－0015。

1.2 主要試劑 熒光金(fluorogold，F(xiàn)G;Invitrogen)，neurobasal培養(yǎng)基(含 L－glutamine，Gibco)，甲基纖維素(methycellulose，Stemcell Technologies)，硫酸慶大霉素 (Amresco)，B27(Gibco)，L－谷氨酸鹽(Sigma)，木瓜蛋白酶 (Worthington)，L－半胱氨酸 (Sigma)，多聚賴氨酸(poly－L－lysine，PLL，Sigma)［8－9］，H2O2(廣州化學試劑廠)，Sen(中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%)，β3－tubulin抗體 (CST)，熒光Ⅱ抗 Alexa Fluor 594(Invitrogen)，Hoechst 33258凋亡試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)，3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體 (CST)，Bcl－2 抗體(Abcam)，細胞色素 C抗體 (CST)，cleaved caspase－3抗體 (CST)。

1.3 儀器 超凈臺，CO2恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡(Leica－DFC 310FX)，微量進樣器 (Hamilton，10 μL)，Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉儀(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 上丘FG逆行標記視神經(jīng)節(jié)細胞 取出生3～5 d SD大鼠，以囟點Bregma為起始點，水平旁開1 mm處左右各取1點。每個點注射深度分別為2.0 mm和1.5 mm，0.6%FG溶液在每個深度注射量為1.25 μL。注射后微量進樣器針頭留置2 min，每側注射總量為 2.5 μL［8－9］。

2.2 視神經(jīng)節(jié)細胞的體外培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 提前24 h在24孔板的孔內鋪直徑1.3 cm的無菌圓玻片，0.1%PLL包被玻片。取提前3～4 d上丘FG標記的SD乳鼠，無菌條件下取雙側視網(wǎng)膜，以5×105U/L木瓜蛋白酶37℃消化后，制備成混合細胞懸液［5－6］。測細胞密度為(4 ～8)×109/L。混合均勻后分到各孔中，每孔含細胞液體量達300 μL。待3 h細胞基本貼壁，再培養(yǎng)細胞15 h。之后用4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS液洗3遍，每次5 min。RGCs鑒定采用免疫細胞化學法，以β3－tubulin(1∶1 000)特異性標記視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞。能被FG和β3－tubulin標記的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞即為視神經(jīng)節(jié)細胞。

2.2.2 計算細胞活力 培養(yǎng)15 h，用4%多聚甲醛固定沖洗，抗熒光淬滅劑封片后，Leica熒光顯微鏡(激發(fā)波長361 nm，發(fā)射波長536 nm)觀察，×10視野拍照，×40視野計數(shù)。采用雙盲法計數(shù)［8－9］，在玻片上固定一點作為計數(shù)起始點，計數(shù)相鄰80個視野(×40)帶熒光RGCs的總和。只對熒光顯微鏡下FG熒光清晰、同時對應白光視野下細胞形態(tài)完整的細胞納入計數(shù)范圍，其它情況不予計數(shù)。RGCs活力=各組帶熒光RGCs總數(shù)/control組帶熒光RGCs總數(shù)×100%，以control組RGCs數(shù)之和作為基數(shù)100%。實驗重復4～5次，算出每次各組的RGCs活力。

2.3 H2O2損傷RGCs模型的建立 隨機分為control組和 H2O24 個濃度(25、50、100、200 μmol/L)組。待細胞鋪板3 h貼壁后，加入含H2O2的培養(yǎng)液進行損傷。15 h培養(yǎng)后計算RGCs活力。

2.4 Sen對氧化應激損傷的RGCs的影響

2.4.1 Sen對正常RGCs的影響 隨機分為control組和 Sen 10、20、40、80、160 μmol/L 組。待細胞鋪板3 h左右貼壁后，更換含有不同濃度Sen的培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h。細胞固定封片后，計算RGCs活力。

2.4.2 Sen對 H2O2損傷 RGCs的影響 隨機分為control組、0.1%DMSO 組、50 μmol/L H2O2組和H2O250 μmol/L+Sen(10、20 和 40 μmol/L)組。培養(yǎng)15 h后固定封片，計算RGCs活力。

2.5 視網(wǎng)膜細胞凋亡和凋亡蛋白的表達 分離的視網(wǎng)膜體外培養(yǎng)，隨機分組為control組、50 μmol/L H2O2組、H2O250 μmol/L+Sen 40 μmol/L 組和 Sen 40 μmol/L組。培養(yǎng)15 h后，進行如下處理。

2.5.1 Sen H2O2損傷視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響 Hoechst 33258可以透過細胞膜，與DNA結合后形成藍色熒光，常用于檢測細胞凋亡。視網(wǎng)膜細胞在處理后，棄去培養(yǎng)基加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍后，加入Hoechst 33258染液避光反應5 min，PBS洗2遍后封片，熒光顯微鏡下拍照(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)。

2.5.2 Western blotting 檢測胞漿 Bcl－2、細胞色素C和cleaved caspase－3蛋白的表達 吸去板中培養(yǎng)液，每孔加60 μL細胞裂解液冰上裂解30 min后，轉移到離心管，4℃ 12 000 r/min離心5 min，上清分裝轉移到離心管中，－20℃保存。蛋白經(jīng)BCA法定量后，配置SDS－PAGE凝膠，上樣電泳，電轉蛋白，抗體孵育后顯影。結果以目的條帶與內參照GAPDH條帶的灰度比值來評定蛋白質表達的相對含量。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 逆行標記和體外培養(yǎng)

1.1 FG標記視網(wǎng)膜 FG通過軸漿逆向傳輸從上丘到達視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。視網(wǎng)膜的矢狀切片(圖1A、B)可見被綠色熒光標記的細胞位于視網(wǎng)膜的是神經(jīng)節(jié)細胞胞體層。視網(wǎng)膜平鋪片(圖1C、D)可以清楚看到整個視網(wǎng)膜滿布被FG標記的RGCs，呈放射狀分布，圖中放射狀分布的黑線為血管，見圖1。

1.2 體外培養(yǎng) 視神經(jīng)節(jié)細胞體外培養(yǎng)能夠存活至少15 h，并能被FG和β3－tubulin成功雙標，見圖2。

Figure 1.RGCs were retrogradely labeled by fluorogold injection in superior colliculi.A，B:labeled RGCs in the retinal slice under fluorescent(A)and bright field(B);C:labeled RGCs in the retinal whole mount;D:enlarged area showed labeled RGCs.GCL:ganglion cell layer;IPL:inner plexiform layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;ONL:outer nuclear layer.圖1 上丘注射熒光金標記視網(wǎng)膜的RGCs

Figure 2.In vitro cultured RGCs(indicated by the arrows)were labeled by fluorogold(A)and β3－tubulin(B).C:the corresponding bright field view.圖2 體外培養(yǎng)的RGCs

2 H2O2損傷RGCs模型建立

不同濃度H2O2損傷RGCs 30 min后RGCs活力見表1，H2O225、50、100 和200 μmol/L 各組RGCs活力與control組相比都下降，差異顯著(P＜0.05)。其中50 μmol/L H2O2損傷 RGCs 30 min 后，RGCs活力在60%～75%之間。因此選此濃度作為H2O2損傷RGCs 30 min的最適損傷濃度來建立損傷模型。

3 Sen對RGCs的影響

3.1 Sen對RGCs活力的影響 不同濃度Sen對RGCs活力的影響見表 1，Sen 10、20 和 40 μmol/L時，RGCs活力與control組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而 Sen 80和 160 μmol/L時，RGCs活力與control組相比活力顯著下降(P＜0.01)。因此選用Sen 10、20和40 μmol/L 3個濃度進行后續(xù)實驗。

3.2 Sen對氧化應激損傷RGCs活力的影響 H2O2損傷后，不同濃度Sen對RGCs的影響見圖3，與control組比較，H2O2組RGCs活力顯著下降 (P＜0.01)。在H2O2損傷后應用10、20和40 μmol/L Sen處理，各組RGCs活力與H2O2組比較有顯著升高(P＜0.05)，且Sen濃度在40 μmol/L時，保護作用最佳。

表1 不同濃度H2O2和Sen對RGCs活力的影響Table 1.The RGCs viability after treatment with different concentrations of H2O2or Sen(%.±sE)

表1 不同濃度H2O2和Sen對RGCs活力的影響Table 1.The RGCs viability after treatment with different concentrations of H2O2or Sen(%.±sE)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

H2O2(n=4) RGCs viability Sen(n=5)RGCs viability Control 100.0 Control 100.00 25 μmol/L 78.4±0.5* 10 μmol/L 103.3 ±5.9 50 μmol/L 63.3±4.4* 20 μmol/L 102.4 ±6.0 100 μmol/L 58.1±4.4* 40 μmol/L 97.4 ±3.3 200 μmol/L 42.7±2.6 ＊＊ 80 μmol/L 84.7 ±2.4 ＊＊——160 μmol/L 79.3 ±2.7＊＊

Figure 3.Effects of Sen on the viability of H2O2－treated RGCs.RGCs were treated with 50 μmol/L H2O2or/and Sen at doses of 10，20 and 40 μmol/L for 15 h.±sE.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2.圖3 不同濃度Sen對H2O2損傷后RGCs活力的影響

4 凋亡相關的檢測結果

4.1 Hoechst 33258染色細胞形態(tài)觀察 Hoechst 33258染細胞核后發(fā)現(xiàn)，control組(圖4A)細胞核呈均一低強度熒光，可見少量高亮度的凋亡形態(tài)細胞核;H2O2組(圖4B)大量細胞核呈現(xiàn)高亮度濃染、核固縮狀態(tài)，凋亡形態(tài)特征的細胞多于control組;H2O2+Sen組(圖4C)高亮濃染、核固縮形態(tài)的細胞數(shù)少于H2O2組;而Sen組(圖4D)凋亡特征形態(tài)的細胞數(shù)少，多數(shù)細胞核呈現(xiàn)均一低強度熒光。

4.2 Sen對凋亡相關蛋白的影響

4.2.1 Bcl－2 蛋白表達 Western blotting結果顯示，與control組比較，H2O2組Bcl－2蛋白表達降低，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L組Bcl－2蛋白表達增高，差異顯著(P＜0.05);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組 Bcl－2蛋白表達增高，差異顯著(P＜0.05)，見圖5。

4.2.2 細胞色素 C表達 Western blotting結果顯示，與control組比較，H2O2組細胞色素C表達升高，差異顯著(P＜0.01);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L組細胞色素C表達降低，差異顯著(P＜0.01);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組細胞色素C表達無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

4.2.3 Cleaved caspase－3 蛋白表達 Western blotting結果顯示，與 control組比較，H2O2組活化的caspase－3蛋白表達升高，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L 組活化的caspase－3蛋白表達降低，但無顯著差異(P＞0.05);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組活化的caspase3蛋白表達降低，差異顯著(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Effects of Sen on the apoptosis of H2O2－treated RGCsdetected using Hoechst 33258 staining.A:control;B:H2O250 μmol/L;C:H2O2+Sen 40 μmol/L;D:Sen 40 μmol/L.Apoptotic cells were indicated by arrows.圖4 Sen對氧化應激損傷的RGCs凋亡的影響

討 論

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)存在于細胞正常代謝過程中［10－13］，并且處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但在某些疾病或病理狀態(tài)如線粒體電子傳遞鏈被中斷后，ATP供應充足時，ROS大量產生。大量研究已證實在海馬的神經(jīng)元［14］、交感神經(jīng)元［15］、小腦的顆粒細胞［16］及 RGCs 等［17］多種神經(jīng)細胞中，ROS在細胞死亡信號通路中都起到一定的作用。視神經(jīng)節(jié)細胞在軸突損傷后能發(fā)生氧化應激而引起凋亡［18－19］，并且存在通過影響線粒體功能引起細胞凋亡［20］。及時阻斷凋亡發(fā)生，保護視神經(jīng)節(jié)細胞成為治療的關鍵。針對氧化應激的發(fā)生，已證實某些中藥皂苷單體有較好的效果。遠志皂苷元能夠有效保護體外培養(yǎng)的海馬的神經(jīng)元抵擋氧化應激產物乙二醛［21］和 H2O2［22］的毒性作用。本實驗進一步證實選擇遠志皂苷元可以對抗氧化應激對RGCs的損傷，從而為RGCs的臨床保護提供了實驗依據(jù)。

Figure 5.Effects of Sen(40 μmol/L)on the expression of Bcl－2，cytochrome C(Cyt C)and cleaved caspase－3 proteins in RGCs after H2O2(50 μmol/L)injury.±sE.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2.圖5 Sen對氧化應激損傷的RGCs Bcl－2、細胞色素C和cleaved caspase－3蛋白表達的影響

本實驗采用H2O2誘導的RGCs損傷模型，觀察遠志皂苷元對損傷RGCs的作用及初步探討作用機制。實驗證實，50 μmol/L H2O2作用于培養(yǎng)3 h后貼壁的RGCs 30 min，即可造成對RGCs的氧化應激損傷，神經(jīng)元的活力降低;而損傷后與Sen 40 μmol/L共培養(yǎng)15 h后，RGCs的活力顯著升高，這與有文獻報道的結果相似［21］。RGCs發(fā)生氧化應激損傷后，細胞凋亡與線粒體途徑非常相關，其中Bcl－2家族、細胞色素C及caspase家族在其中又扮演非常關鍵的角色，我們的結果發(fā)現(xiàn)，與control組比較，H2O2組的細胞色素C和cleaved caspase－3蛋白表達明顯增加，Bcl－2蛋白表達顯著減少(P＜0.05);而H2O2+Sen 40 μmol/L組與 H2O2組相比，Bcl－2蛋白表達明顯增高，細胞色素C蛋白的表達量顯著降低(P＜0.05)。cleaved caspase－3蛋白表達量也有降低。說明Sen可能通過上調Bcl－2和下調促凋亡蛋白來實現(xiàn)抑制細胞凋亡發(fā)生。

由此可見，Sen具有一定的抗氧化作用。其作用機制可能與穩(wěn)定細胞內線粒體膜，減少細胞色素C的釋放，上調抑凋亡蛋白Bcl－2的表達有關。由于原代RGCs相對易損傷，其純化過程復雜，原代視網(wǎng)膜細胞混合培養(yǎng)模型又最接近于視網(wǎng)膜的正常生理狀態(tài)，因此是篩選有效藥物的首選模型。但對于機制的初步研究，此結果是建立在混合視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)模型的基礎上，其保護途徑究竟是只通過影響RGCs本身，還是同時也通過影響其它視網(wǎng)膜細胞來實現(xiàn)調控，需要通過純化RGCs模型的進一步驗證，這也將成為下一步研究的重點。

［1］Tezel G.Oxidative stress in glaucomatous neurodegeneration:mechanisms and consequences［J］.Prog Retin Eye Res，2006，25(5):490 －513.

［2］Dvoriantchikova G，Grant J，Santos AR，et al.Neuronal NAD(P)H oxidases contribute to ROS production and mediate RGC death after ischemia［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(6):2823 －2830.

［3］Lieven CJ，Hoegger MJ，Schlieve CR，et al.Retinal ganglion cell axotomy induces an increase in intracellular superoxide anion ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(4):1477－1485.

［4］Swanson KI，Schlieve CR，Lieven CJ，et al.Neuroprotective effect of sulfhydryl reduction in a rat optic nerve crush model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(10):3737－3741.

［5］韋 佳，陸大祥，戚仁斌，等.抗衰益智方Ⅰ對小鼠學習記憶能力以及海馬膽堿乙酰轉移酶表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(10):2051.

［6］閆 明，李 萍.遠志抗衰老作用的研究［J］.實用藥物與臨床，2006，9(1):22－23.

［7］Liang Z，Shi F，Wang Y，et al.Neuroprotective effects of tenuigenin in a SH－SY5Y cell model with 6－OHDA－induced injury［J］.Neurosci Lett，2011，497(2):104 －109.

［8］Zhang X，Zhang M，Laties AM，et al.Stimulation of P2X7 receptors elevates Ca2+and kills retinal ganglion cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(6):2183 －2191.

［9］Hu H，Lu W，Zhang M，et al.Stimulation of the P2X7receptor kills rat retinal ganglion cells in vivo［J］.Exp Eye Res，2010，91(3):425 －432.

［10］Clark RA.Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase［J］.J Infect Dis，1999，179(Suppl 2):S309 －S317.

［11］Dalton TP，Shertzer HG，Puga A.Regulation of gene expression by reactive oxygen［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1999，39:67 －101.

［12］Finkel T.Oxygen radicals and signaling［J］.Curr Opin Cell Biol，1998，10(2):248 －253.

［13］Goldschmidt Clermont PJ，Moldovan L.Stress，superoxide，and signal transduction［J］.Gene Expr，1999，7(4－6):255－260.

［14］Chan SL，Tammariello SP，Estus S，et al.Prostate apoptosis response－4 mediates trophic factor withdrawal－induced apoptosis of hippocampal neurons:actions prior to mitochondrial dysfunction and caspase activation［J］.J Neurochem，1999，73(2):502－512.

［15］Greenlund LJ，Deckwerth TL，Johnson EM Jr.Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis:a role for reactive oxygen species in programmed neuronal death［J］.Neuron，1995，14(2):303－315.

［16］Schulz JB，Weller M，Klockgether T.Potassium deprivation－induced apoptosis of cerebellar granule neurons:asequential requirement for new mRNA and protein synthesis，ICE － like protease activity，and reactive oxygen species［J］.J Neurosci，1996，16(15):4696 －4706.

［17］Geiger LK，Kortuem KR，Alexejun C，et al.Reduced redox state allows prolonged survival of axotomized neonatal retinal ganglion cells［J］.Neuroscience，2002，109(3):635－642.

［18］Levkovitch－Verbin H，Harris－Cerruti C，Groner Y，et al.RGC death in mice after optic nerve crush injuryoxidative stress and neuroprotection［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(13):4169 －4174.

［19］Mackey AM，Sanvicens N，Groeger G，et al.Redox survival signalling in retina－derived 661W cells［J］.Cell Death Differ，2008，15(8):1291 －1303.

［20］Lieven CJ，Vrabec JP，Levin LA.The effects of oxidative stress on mitochondrial transmembrane potential in retinal ganglion cells［J］.Antioxid Redox Signal，2003，5(5):641－646.

［21］Chen YJ，Huang XB，Li ZX，et al.Tenuigenin protects cultured hippocampal neurons against methylglyoxal－induced neurotoxicity［J］.Eur J Pharmacol，2010，645(1－3):1－8.

［22］張 晶，戚仁斌，汪志剛，等.遠志皂苷元對H2O2誘導的大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及其機制［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1059－1065.