實驗動物金黃色葡萄球菌LAMP檢測方法的建立

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，廣泛存在于空氣和水中，是人和動物體表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常見菌，也是一種條件性致病菌。金黃色葡萄球菌可引起人和動物皮膚軟組織感染、敗血癥、乳房炎、心內膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎、筋膜炎、關節炎、中毒性休克綜合征等。對于實驗大、小鼠，可引起化膿性睪丸炎、前列腺炎、卵巢膿腫、子宮內膜炎等，嚴重影響鼠群繁育和動物實驗結果［1］。中華人民共和國國家標準GB14922.2-2011《實驗動物微生物學等級及監測》將金黃色葡萄球菌列為SPF級大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠和兔等嚙齒類實驗動物必須檢測和排除的病原菌。

實驗動物金黃色葡萄球菌檢測通常采用分離培養和生化鑒定相結合的方法，這種方法至少需要5d。環介導等溫擴增是近年來發展起來的一項基因體外擴增的技術，利用4條不同的引物特異性地識別目的基因上面的6個特定序列，借助具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下催化新鏈的合成［2］。在反應產物中加入 SYBR green I，綠色為陽性，橙色為陰性，可以直接肉眼觀察判定結果。該技術由于操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優點被廣泛應用于生命科學各領域。本研究將LAMP技術應用于實驗動物金黃色葡萄球菌檢測中，實現目的基因高效、快速的擴增，大大提高了檢測效率、降低了檢測成本。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本實驗室保藏；金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌均為本實驗室分離保藏。

1.1.2 主要試劑：細菌基因組DNA小量試劑盒購自AxyPrep公司；Bst DNA Polymerase購自 NEB公司；Betaine購自Sigma公司；dNTP m ixture、MgCl2、購自 TaKaRa寶生物(大連)工程有限公司；SYBR green I熒光染料購自北京天恩澤基因科技有限公司；DEPC水購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計：根據金黃色葡萄球菌特有的nuc基因，利用Primer Explorer IV設計4條引物［3］，由北京閱微基因技術有限公司合成(表1)。

1.2.2 菌株培養：金黃色葡萄球菌ATCC 25923接種于血瓊脂平皿，37℃培養18h～24h，挑取單菌落轉接于營養肉湯培養基，37℃培養過夜。取100μL菌液用于稀釋與計數，其余菌液6000r/m in離心30min，收集菌體溶于 DEPC水中，-20℃保存備用。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的稀釋與計數：取100μL增菌培養后的菌液，用無菌PBS進行10倍遞增稀釋，每個稀釋度吸取100μL接種到血瓊脂平板上，每個稀釋度做2個平皿，L棒涂布均勻，于37℃培養24h后進行計數。

1.2.4 模板制備：采用熱裂解法制備粗制模板［4］。取50μL菌液溶于50μL DEPC水，電磁爐煮沸10m in，12000r/m in離心 5m in，取上清液為粗制模板，-20℃保存備用。

1.2.5 LAMP擴增反應：

1.2.5.1 25μL擴增體系和反應條件［5］：1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、1.6mmol/L dNTP、4mmol/L MgCl2、0.8mol/L betaine、LAMP buffer(20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4、0.1%TritonX-100)、1μL模板、8U Bst酶。加入模板后煮沸5min，4℃ 3min，再加入Bst酶，60℃ 60min，80℃ 3min，4℃保存。

1.2.5.2 特異性試驗：按照1.2.5.1的25μL擴增體系配制反應液，分別以金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌的粗提DNA為模板進行擴增。

1.2.5.3 優化反應體系：按照1.2.5.1的25μL擴增體系配制反應液，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923的粗提DNA為模板，對LAMP反應體系中的dNTP濃度、Mg2+濃度和betaine濃度以及反應時間進行優化。

表1 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers

1.2.5.4 靈敏性試驗：按照優化后的反應體系進行擴增。將模板濃度做倍比稀釋，使每個反應體系的模板量為1cfu、2cfu、3cfu、4cfu、5cfu、10cfu。

1.2.5.5 方法驗證：取20粒SPF級小鼠糞便。經分離培養和生化鑒定［6］證實有表皮葡萄球菌存在。將20份樣品隨機平均分為兩組，每組中5份樣品混入少量金黃色葡萄球菌 ATCC 25923。一組粗提DNA為LAMP反應的模板，編號為1～10，11號為空白對照；另一組用AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒提取DNA為LAMP反應的模板，編號為1'～10'，11'號為空白對照。按照優化后的25μL擴增體系配制反應液進行擴增。擴增產物以5μL上樣進行凝膠電泳觀察結果，粗提DNA的一組每管剩余20μL加入2μL 100×SYBR green I(以無水DMSO將10000×SYBR green I稀釋100倍)肉眼直接觀察，橙色為陰性，綠色為陽性。

2 結果

2.1 特異性試驗

對供試菌株分別進行LAMP。結果顯示，金黃色葡萄球菌反應管電泳結果均呈陽性，而其他菌株反應管電泳結果均呈陰性(見圖1)，說明所設計的引物具有極強的特異性。

圖1 引物特異性凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of the LAMP-amplified DNA using specific primersNote： M： marker DL500；1： Staphylococcus aureus ATCC25923；2：Staphylococcus aureus；3：Salmonella spp.；4：Yersinia enterocolitica；5： Yersinia pseudotuberculosis；6：Klebsiella pneumoniae；7：blank control.

2.2 優化反應體系

2.2.1 dNTP濃度對LAMP反應的影響：由圖2可見，dNTP的濃度為1.6mmol/L～2.0mmol/L時均能擴增出靶DNA。當dNTP的濃度達到2.0mmol/L時，就能夠得到均一、穩定的條帶，繼續增加dNTP濃度至2.4mmol/L，擴增效率稍有降低。

2.2.2 Mg2+濃度對 LAMP反應的影響：由圖3可見，Mg2+的濃度為2mmol/L～7 mmol/L時均能擴增出靶DNA。當Mg2+的濃度達到6mmol/L時，就能夠得到均一、穩定的條帶，繼續增加Mg2+濃度至7 mmol/L，擴增效率稍有降低。

2.2.3 Betaine濃度對 LAMP反應的影響：由圖4可見，當betaine的濃度在0.6mol/L～1.0mol/L范圍內時對擴增反應的影響并不大，但仍可見當betaine的濃度達到0.8mol/L時，擴增效果最好。

2.2.4 反應時間對LAMP反應的影響：在電泳30min時就能觀察到特異性條帶，但在60min才能得到均一、穩定的電泳條帶(圖5)。

圖2 dNTP濃度對LAMP反應的影響Fig.2 Effect of dNTP concentration on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：dNTP 0.4mmol/L；2：dNTP 0.8mmol/L；3：dNTP 1.2mmol/L；4：dNTP 1.6mmol/L；5：dNTP 2.0 mmol/L；6：dNTP 2.4mmol/L；7：blank control.

圖3 Mg2+濃度對LAMP反應的影響Fig.3 Effect of Mg2+concentration on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：Mg2+2mmol/L；2：Mg2+ 3mmol/L；3：Mg2+4mmol/L；4：Mg2+5mmol/L；5：Mg2+ 6mmol/L；6：Mg2+7 mmol/L；7：Mg2+8mmol/L；8：blank control.

2.3 敏感性試驗

根據條件優化試驗結果調整金黃色葡萄球菌LAMP反應體系進行敏感性試驗，結果顯示，所設計的特異性引物在最佳反應條件下，最低可檢測到2cfu熱裂解法粗提DNA的金黃色葡萄球菌。(圖6)

圖4 Betaine濃度對LAMP反應的影響Fig.4 Effect of betaine concentration on the LAMP reactionNote：M：marker DL500；1：Betaine 0.6M；2：Betaine 0.7 mol/L；3：Betaine 0.8mol/L；4：Betaine 0.9 mol/L；5：Betaine 1.0mol/L；6：Betaine 1.1mol/L；7：blank control.

圖5 反應時間對LAMP反應的影響Fig.5 Effect of reaction time on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：20min；2：30min；3：40min；4：50min；5：60min；6：blank control.

圖6 LAMP敏感性電泳結果Fig.6 Agarose gel electrophoretogram of LAMP-amplifiedDNA of SA at different DNA concentrationNote：M：marker DL500；1：1cfu；2：2cfu；3：3cfu；4：4cfu；5：5cfu；6：10cfu；7：blank control.

2.4 方法驗證

對供試糞便樣品分別進行用LAMP進行檢測。結果顯示，未添加金黃色葡萄球菌ATCC 25923的供試樣品凝膠電泳結果均呈陰性，添加金黃色葡萄球菌ATCC 25923的供試樣品凝膠電泳結果均呈陽性(圖7)，說明引物對表皮葡萄球菌并無交叉反應。同時，肉眼直接觀察加入SYBR Green I熒光染料的反應管，1～5為橙色、6～10為淡綠色、11為橙色，與凝膠電泳結果相同。

圖7 LAMP瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.7 Results of of LAMP-agarose gel electrophoresisNote：M：Marker DL500；1～5：stool samples of SPF mice processed by thermal cracking；6～10：Thermal cracking stool samples added with Staphylococcus aureus ATCC25923of SPF mice processed by thermal cracking；11：Blank control；1'～5'：Stool samples of SPF mice processed by kit；6'～10'：Stool samples added with Staphylococcus aureus ATCC25923of SPF m ice processed by kit；11'：Blank control.

3 討論

根據生物學特性、表型特征鑒定細菌的傳統的分離培養法是實驗動物國家標準中推薦的檢測方法，這種方法存在許多不足之處：耗時長且步驟繁瑣，要求有經驗非常豐富的科研人員，并且這些方法很容易出現漏檢。PCR技術雖然越來越多地被應用于實驗動物微生物檢測，但是因為需要特殊的儀器，并且容易發生非特異性擴增使得它在實驗動物微生物檢測中的應用受到限制。LAMP技術較常規的PCR技術操作更簡單；無需昂貴的實驗儀器，反應不需要控制溫度的變化，僅需一臺水浴鍋就可完成整個擴增過程；結果判定簡便，可直接根據有無焦磷酸鎂沉淀的生成，或者根據加入熒光染料SYBR green I后顏色的變化，直接肉眼觀測結果，省去PCR中的變溫過程和電泳觀察結果的步驟，大大縮短試驗時間；另外4條引物必須完全匹配才能進行擴增使得LAMP技術比PCR技術具有更強的特異性。故LAMP技術能夠滿足基層、現場、即時、大批量樣本檢測的需要，克服了傳統PCR方法的不足之處。

金黃色葡萄球菌的nuc基因編碼耐熱核酸酶，位于染色體上，長966bp。Brakstad等［7］人分別應用PCR的方法證明了nuc基因只存在于金黃色葡萄球菌中，而在其他葡萄球菌和非葡萄球菌中均不存在，是金黃色葡萄球菌的高特異性基因。

本研究針對金黃色葡萄球菌特異性的nuc基因設計的LAMP技術是一種特異性強、敏感性高、操作極其簡便的快速檢測方法。在25μL的LAMP體系中(1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、2.0mmol/L dNTP、6mmol/L MgCl2、0.8mol/L betaine、20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4、0.1% ritonX-100、模板 DNA、8U BstDNA聚合酶)僅需要40min～60min，就可以清晰檢測出2cfu粗提DNA的金黃色葡萄球菌。擴增結束后直接在反應管中加入只與雙鏈DNA結合的SYBR green I可通過陽性結果呈綠色、陰性結果呈橙色，肉眼直接判定結果。從提取 DNA開始，在1.5h～2h內即可完成全部檢測過程。諸多優點使得這項技術不僅能夠滿足對檢測特異性、敏感性的要求，也能夠滿足實驗動物飼養機構和基層實驗室對大批量實驗動物是否感染金黃色葡萄球菌進行初步篩選的需要。

［1］方喜業，邢瑞昌，賀爭鳴.實驗動物質量控制［M］.北京，中國標準出版社，2008：371-372.

［2］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Ices，2000，28(12)：63.

［3］Eiken Chenieal Co.Ltd.The principles of LAMP method［EBIOL］.http://loopamp.eiken.eo.iP/e/tech/index.html.2003，10.

［4］嚴劍波，王虹玲，朱水榮，等.單增李斯特菌LAMP方法的建立［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19(9)：2048-2050.

［5］周義正，王昌富，李向陽，等.環介導等溫擴增快速檢測陽性血培養瓶中的金黃色葡萄球菌［J］.中華醫院感染學雜志，2009，19(9)：2075-2077.

［6］廖延雄.獸醫微生物實驗診斷手冊［M］.北京農業大學出版社，1995，81-114.

［7］Brakstad OG， Aasbakk K， Maeland JA. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene［J］.J Clin Microbiol，1992，30(7)：1654-1660.