白細胞介素21對SHIV感染的恒河猴外周血CD8+T細胞分泌γ干擾素的影響

趙長城，高錫強，吳芳新，張偉倫，薛 婧，魏 強，秦 川

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

IL-21是一種新近發現的、具有免疫調節作用的細胞因子，可通過多條途徑影響CD8+T細胞介導的抗病原體作用［1］，但目前對于 IL-21在抗 SIV/SHIV感染中的作用研究很少。本研究測定了IL-21誘導SHIV感染猴外周血CD8+T細胞分泌 IFN-γ的水平，以期掌握 IL-21體外誘導病毒特異性的細胞免疫的動力學規律，為今后艾滋病發病機制的研究、HIV候選疫苗的篩選提供參考。

1 材料和方法

1.1 標本來源

健康猴和SHIV1157ipd3N4感染的中國恒河猴EDTA抗凝全血。

1.2 主要試劑

Mouse anti-monkey CD3 Ab(Invitrogen)，Purified anti-human CD28Ab(BD)，APC anti-human IFN-γ Ab(BioLegend)，FITC anti-human CD4Ab (BioLegend)，PE anti-human CD8a Ab(BioLegend)，Brefeldin A(BFA)(BioLegend)，Triozol(Invitrogen)，AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Ex Taq DNA聚合酶(大連寶生物)，rh IL-21(Invitrogen)，Monkey IFN-γ ELISAPROkit(Mabtech)，淋巴細胞分離液 Ficoll-PaqueTMPLUS(GE)，RPMI 1640完全培養基(含10%FCS、2.5%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、2%雙抗)。

1.3 RT-PCR引物設計及合成

恒河猴 IFN-γ基因上下游引物序列［2］分別為5'-GCTTTTCAGCTCTGCATTGT-3'和5'-CGACAGTTC AGCCATCATTTG-3'，GAPDH上下游引物序列［3］分別 為5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'和 5'-GGATGATGTTCTGGAGAGCC-3'，所有引物均由Invitrogen公司合成。

1.4 外周血CD8T淋巴細胞的分離

分離猴外周血單個核細胞(PBMCs)，用CD8+T細胞陽性磁珠 CD8microbead kit nonhuman-primate (Miltenyi Biotec)分選出CD8+T細胞。再用 RPMI 1640完全培養基培養于37℃、5%CO2孵箱，備用。

1.5 ELISA檢測IL-21誘導CD8T細胞培養上清液中IFN-γ濃度

用RPMI 1640完全培養基調PBMCs濃度為1.0×106/mL，24孔板中每孔加入1m L。每孔分別加入0、1、5、10和 15ng/m L IL-21和 1μg/m L anti-CD3刺激 48h后，收集細胞培養上清液。應用Human IL-21ELISA MAXTMDeluxe SET(BioLegend)檢測上清液中IFN-γ的濃度。

1.6 RT-PCR檢測IL-21誘導CD8T細胞IFN-γ m RNA的表達水平

加入1μg/m L anti-CD3和10ng/m L IL-21刺激5.0×105個健康猴和感染猴 CD8+T細胞48h，同時以未刺激的CD8+T細胞作為陰性對照。TRIzol法提取細胞總RNA。將RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增 IFN-γ基因片段。擴增體系為20μL，其中10×Ex Taq buffer 2μL、dNTPs 2μL、Ex Taq DNA聚合酶 0.2μL、上下游引物(20μM/μL)各0.8μL、cDNA 2μL、滅菌去離子水12.2μL。反應條件為94℃5min，94℃30s(×35)，60℃30s(×35)，72℃ 1min(×35)，72℃延伸5min。取PCR產物5μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.7 流式細胞術分析 IL-21誘導 IFN-γ陽性CD8T細胞百分比

用完全培養基調PBMCs濃度為1.0×106/m L。實驗一：預先用1μg/m L anti-CD3和1μg/m L anti-CD28孵育 PBMC 1h，接著分別在加入 10μg/m L BFA后1、2、3、4、5和6h加入10ng/m L IL-21。實驗二：設CD3/CD28組、IL-21組、CD3/CD28+IL-21組，并設空白對照組。CD3/28組和 CD3/28+ IL-21組分別加入 1μg/m L anti-CD3 +1μg/m L anti-CD28孵育 48h后，IL-21組和 CD3/CD28 + IL-21組分別加入10ng/m L IL-21，以上四組均在實驗前5h加入1μg/mL BFA。

孵育結束后，首先進行胞外 anti-CD8、CD3Ab染色，接著固定細胞、滲透。最后，染胞內anti-IFN-γ抗體。檢測分泌 IFN-γ的CD8+T細胞所占的百分比。

1.8 統計學方法

數據以均數±標準差表示，應用Prism 5.0統計軟件進行分析。各組間指標比較用 t檢驗，＊＊＊表示P＜0.0001，＊＊表示P ＜0.05。

2 結果

2.1 IL-21誘導 SHIV感染的CD8T細胞分泌IFN-γ的最佳作用濃度分析

未用IL-21刺激時，CD8+T細胞分泌 IFN-γ的量為1046.97±60.61pg/m L。當IL-21的濃度從1ng/m L增加到10ng/m L時，其誘導感染的CD8+T細胞分泌IFN-γ的量也相應增加，并在IL-21為10 ng/m L時IFN-γ分泌量達到峰值(3280.17±267.42pg/m L)。與 5ng/m L IL-21誘導的IFN-γ分泌量(1406.93±345.84pg/mL)相比，10ng/mL IL-21誘導的IFN-γ分泌量明顯增加，兩者之間的差異有統計學意義(P=0.0018)。但15ng/mL IL-21誘導的IFN-γ分泌量(2964.40±135.92pg/m L)與 10ng/m L IL-21組比較，差異無統計學意義(P = 0.1423)(圖1)。

圖1 不同劑量IL-21處理的CD8+T細胞培養上清液中IFN-γ濃度Fig.1 IFN-γ concentrations in the culture supernatant of CD8+T cells stimulated with IL-21at different doses

2.2 相同濃度IL-21刺激正常和感染 CD8T細胞效果的比較

在沒有加入 IL-21之前，不論是正常還是感染的CD8+T細胞，均產生一定基礎水平的IFN-γ (972.39±262.36pg/m L vs.1118.32±232.31pg/m L)，且兩者差異不顯著(P＞0.05)。10ng/m L IL-21處理后，感染的CD8+T細胞分泌的IFN-γ量(3019.58±203.09 pg/m L)明顯低于正常的CD8+T細 胞(7510.25 ± 437.76 pg/m L)(P ＜0.0001)(圖2)。

圖2 IL-21誘導正常和感染CD8+T細胞培養上清液中IFN-γ濃度Fig.2 IFN-γ concentrations in the culture supernatant of healthy and infected CD8+T cells induced with IL-21

2.3 IL-21處理后正常和感染 CD8T細胞分泌IFN-γ的比較

RT-PCR方法檢測結果證實，IL-21誘導組IFN-γ mRNA的表達較未刺激組明顯增加(圖3)。

圖3 RT-PCR檢測感染CD8+T細胞中IFN-γ mRNA的表達Fig.3 Expression of IFN-γ mRNA in the infected CD8+T cells by assayed by RT-PCRM.2000bp marker；“+”：Stimulated with IL-21；“-”：Unstimulated with IL-21

2.4 IL-21處理后 CD8T細胞分泌 IFN-γ的分析

適當的刺激時間是檢測細胞因子的關鍵。因此，我們選擇了不同時間點進行檢測。結果顯示，隨著IL-21刺激時間的延長，分泌IFN-γ的CD8+T細胞的百分比逐漸增加(圖4)，并在刺激4h時達到最高，隨后逐漸下降。圖5即為IL-21刺激CD8+T細胞4h時的流式圖。

圖4 不同時間刺激后IFN-γ陽性CD8+T細胞的百分比Fig.4 The percentage of IFN-γ-positive CD8+Tcells after different times of IL-21stimulation

IL-21誘導培養PBMCs 48h后，應用流式技術檢測不同刺激條件下，分泌 IFN-γ的CD8+T細胞所占全部 CD8+T細胞的百分比。與陰性對照組［(0.28±0.08)%］相比，CD3/CD28組［(1.55± 0.15)%］、IL-21組［(0.74±0.10)%］，CD3/CD28+IL-21聯合組［(2.04±0.20)%］均能誘導 IFN-γ陽性CD8+T細胞所占的比例增加，且存在統計學上的差異(P＜0.0001)。單獨 IL-21組誘導 IFN-γ表達的作用弱于CD3/CD28組，但在CD3/CD28的

圖5 IL-21刺激CD8+T細胞4h后IFN-γ陽性細胞百分率Fig.5 The percentage of IFN-γ-positive CD8+T cells stimulated with IL-21for 4h

圖6 不同刺激源誘導的IFN-γ陽性CD8+T細胞的比較Fig.6 Comparison of the percentages of IFN-γ-positive CD8+T cells treated by different stimulators(CD3/CD28，IL-21，CD3/CD28+IL-21mixture)，detected by flow cytometry.協同下，IL-21可以顯著誘導IFN-γ的表達(圖6)。

3 討論

適應性免疫反應在機體抗 HIV/SIV感染中具有非常重要的作用。細胞免疫在控制病毒復制，延緩疾病進程的作用已得到證實［4］。SHIV/恒河猴模型體內存在特異性CD8+T淋巴細胞參與的抗病毒免疫反應，IFN-γ是免疫系統中非常重要的免疫調節因子，具有抗病毒，免疫調節和抗細胞異常增殖的作用，與病毒性疾病的嚴重程度戚戚相關。CD8+T細胞是 IFN-γ合成的主要細胞［5］。本文研究了IL-21對 SHIV感染 CD8+T細胞分泌 IFN-γ的作用，以及不同的條件培養基對于產生IFN-γ的影響。這些結果證實IL-21能調節IFN-γ的產生，提示IL-21在機體抗HIV/SIV感染中發揮積極的影響。

IL-21具有促進感染CD8+T細胞分泌IFN-γ的作用。CD8+T淋巴細胞是體內主要的效應細胞，研究表明，體外實驗中IL-21可誘導CD8+T細胞產生IFN-γ［6］。據報道，IL-21對正常的CD8+T細胞誘導IFN-γ呈劑量相關性［7］。但本文應用 IL-21刺激SHIV感染恒河猴外周血 CD8+T細胞，研究 IL-21對SHIV感染的CD8+T淋巴細胞誘導IFN-γ的能力，從圖1可知，10ng/m L IL-21誘導SHIV感染恒河猴外周血 CD8+T細胞分泌 IFN-γ效果最佳，并不呈劑量相關性。由圖2可見，使用相同濃度的IL-21分別誘導正常和感染的CD8+T細胞，兩者產生的IFN-γ均有不同程度的提高。但正常的CD8+T細胞分泌的IFN-γ量顯著高于感染的CD8+T細胞。結果提示，SHIV的感染部分影響了CD8+T細胞的效應功能。本研究結果一方面證實了IL-21的確可以在一定程度上恢復缺失的CD8+T細胞功能，同時也說明，單獨IL-21尚不能完全糾正缺失的功能，以后需在IL-21與其協同作用物上深入研究。有報道證實，當它與IL-15或 IL-18組合應用時，顯示出明顯的協同作用，強烈誘導細胞分泌IFN-γ［8］。但其中機制尚不明了。應用RT-PCR方法從mRNA水平檢測的結果，與應用ELISA方法從蛋白質水平檢測的結果是一致的。

不同的條件培養基和刺激時間影響IL-21誘導的感染CD8+T細胞產生 IFN-γ的能力。目前，對細胞免疫的研究已經存在多種替代方法，而流式細胞術具有多色熒光染色的優勢。應用其檢測胞內細胞因子，特別是對 IFN-γ的檢測可以用來評價抗原特異性的細胞免疫水平。本研究應用流式技術檢測IL-21誘導 PBMCs后，結果證實，與對照組相比，IL-21組、CD3/CD28+IL-21聯合組中分泌IFN-γ的CD8+T細胞所占比例明顯增加，且存在統計學上的差異(P＜0.0001)。此外，在本次試驗中我們也比較了不同的刺激時間產生 IFN-γ的能力。結果表明4h為刺激CD8+T細胞胞內IFN-γ合成的最佳時間。因而推測IL-21對SHIV/恒河猴模型的免疫水平有調節作用，其機制與誘導IFN-γ產生有關，但要充分理解IL-21的抗病毒作用尚需進行進一步的研究。

綜上所述，本研究發現IL-21通過改善CD8+T細胞的功能從而發揮重要的保護性作用，其作用機制可能與誘導 IFN-γ分泌有關。本研究結果為HIV/SIV感染的治療提供了新的思路。

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