瘦素對肥胖哮喘大鼠氣道平滑肌細胞干擾素調節因子1表達的影響

卞 宏，王莉君，李慧婷，郝 璐，朱述陽，宋 琳，劉 敏

(1徐州醫學院附屬醫院，江蘇徐州210002;2徐州醫學院附屬第三醫院; 3徐州醫學院附屬第二醫院)

瘦素是脂肪組織表達的促炎分子的中心成員，肥胖患者瘦素表達是增加的［1］。肥胖哮喘多表現為非EOS型炎癥反應［2］，往往表現為激素抵抗。干擾素調節因子1(IRF-1)在介導激素抵抗方面起到重要作用［3］，但瘦素對IRF-1表達的影響鮮有報道，本實驗通過建立肥胖及哮喘大鼠模型，瘦素干預體外培養氣道平滑肌細胞(ASMC)，檢測IRF-1的表達情況，為易發生激素抵抗的肥胖性哮喘的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性4周齡SD大鼠60只(徐州醫學院動物中心提供);卵蛋白(OVA)(美國Sigma公司);瘦素(美國Alexis公司);總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);RT-PCR試劑盒(美國Promega公司);大鼠β-actin引物(上海生工生物工程技術服務有限公司);GR β antibody(美國Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 肥胖模型的建立 不銹鋼籠單籠飼養，12 h光照/12 h黑暗，室溫為22～25℃，濕度為40% ～70%。適應性飼養1周后，將大鼠隨機分為正常體質量組及肥胖組，每組均30只，分別喂食基礎飼料(每100 g提供能量1 697.1 kJ)及高能飼料(每100 g提供能量1 951.7 kJ，其中35%為脂肪提供)，自由飲蒸餾水，每周稱重，喂養7周。本實驗以超過平均大鼠體質量1/3者為肥胖標準。

1.2.2 哮喘模型的復制 將正常體質量組再分為對照組(A組)及哮喘組(B組)，肥胖組亦分為對照組(C組)及哮喘組(D組)。喂養7周后，B、D組大鼠于第1天腹腔注射含有1 mg OVA與20 μg的氫氧化鋁的NS 0.5 mL致敏，并于第8天重復注射1次。于第15天開始給予1%OVA溶液10 mL霧化激發，每次30 min，持續2周，每周3次。A組與C組以NS代替OVA致敏和激發。

1.2.3 致敏血清采集及細胞培養 末次霧化24 h后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，取B組和D組大鼠心臟血，分離血清，滅活濾菌備用，分別用于B組和D組培養的ASMC干預。無菌摘取A、B、C、D組大鼠氣道平滑肌組織，貼壁法進行細胞的原代培養。用胰酶消化法進行ASMC傳代并自然純化，實驗用第5～6代細胞。培養的ASMC經形態學觀察和免疫組化法測肌動蛋白(a-actin)的表達進行鑒定。

1.2.4 瘦素受體(OB-R)mRNA的RT-PCR測定分別收集各組ASMC，以TRIzol法提取細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度，采用一步法RTPCR反應體系。擴增OB-R基因的引物序列，上游為:5'-CAGATTCGATATGGCTTAAATGG-3'，下游為: 5'-GTTAAAATTCACAAGG-GAGGCA-3'，擴增產物的長度為474 bp。擴增內參照β-actin基因的引物序列，上游為5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3'，下游為5'-AGCCATGCCAAATGTGT-CAT-3'，擴增產物的長度為473 bp。反應條件:48℃，45 min，1個循環; 94℃，2 min，1個循環;94℃、50℃各30 s，68℃為2 min，各40個循環;最后68℃，7 min，1個循環。以β-actin基因作為內對照。取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外照相并行掃描。

1.2.5 Western blot測定IRF-1蛋白的表達 將第5代ASMCs按5×105接種于6孔板，分別用NS和瘦素(50 ng/mL)干預A、B、C、D組細胞48 h后提取細胞總蛋白，經電泳、轉膜后雜交，一抗為兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶偶聯羊抗兔IgG，以NBT/BCIP顯色。條帶灰度分析用image J軟件。

1.3 統計學方法 實驗數據以SPSS13.0統計軟件包分析，計量數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用q檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 ASMC鑒定結果 用倒置相差顯微鏡觀察，培養的ASMC呈梭形，平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯呈典型“峰谷”狀。免疫組化顯示抗平滑肌α-actin抗體呈陽性染色，胞質內見大量綠色熒光，證實所培養細胞是ASMC。見封二圖3、4。

2.2 OB-R mRNA的表達 RT-PCR結果表明，A～D 4組在500 bp處均有明顯條帶顯示，其大小與OB-R基因片段的大小相符。說明ASMC上有OB-R的表達。圖片分析結果顯示:與A組比較，B、C及D組表達OB-R mRNA增加(P＜0.01)，D組較B、C組增加(P＜0.01)，B、C兩組相比結果差異無統計學意義。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測各組ASMC OB-R mRNA的表達注:M為DNA marker，A～D分別為A～D 4組的目的基因片段

2.3 瘦素對各組IRF-1蛋白的表達 在NS干預的情況下，B、C組均較A組細胞IRF-1蛋白表達量增加(P＜0.05)，但均比D組減弱(P＜0.05)，而B、C兩組蛋白表達量之間無明顯差異(P＞0.05)。在瘦素干預的情況下，各組細胞IRF-1蛋白表達量均分別較相應的NS干預組蛋白表達量增加(P＜0.01)，且B、C組細胞GR β蛋白表達量均較A組增加(P＜0.05)，較D組減弱(P＜0.05)，而B、C組蛋白表達量之間仍無明顯差異(P＞0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 Western blot檢測各組IRF-1蛋白含量的變化

肥胖者脂肪組織可表達許多促炎分子［4］，如瘦素、腫瘤壞死因子(TNF-α)等。研究證明，肥胖/肥胖哮喘患者具有較高的瘦素水平［5，6］。瘦素是脂肪組織表達的促炎分子的中心成員，其生物學效應是通過游離的瘦素與相應的受體(OB-R)結合后發揮的，可參與哮喘氣道高反應性、氣道炎癥及Th1/Th2細胞因子的調節等。在鼠和人的肺泡、支氣管上皮細胞和ASMC［7］均有OB-R的表達。本實驗結果顯示ASMC上有OB-R的表達，與文獻報道一致，且肥胖哮喘大鼠與正常體質量哮喘大鼠相比，其ASMC表達較高的OB-R mRNA，差異具有統計學意義。

現已證實，ASMCs在支氣管哮喘氣道炎癥及氣道重塑的發生機制方面起重要作用，它還發生自身基因的改變，最終導致對常規激素治療不敏感。如TNF-α和IFN-γ聯合急劇降低皮質醇抑制ASMCs表達CD38的能力，從而引起ASMCs高反應性［8］。細胞中轉錄因子C/EBPα在抑制炎癥和增殖中起至關重要的作用，其缺乏與哮喘有關［9］，C/EBPα缺乏則ASMCs增殖加快，且使糖皮質激素抑制增殖作用喪失［10］。以上說明ASMCs在哮喘激素抵抗中起到重要作用。IRF-1是IRF家族中最早被發現的因子，在分子水平上研究最廣泛。IRF-1是一種核轉錄因子，既往研究多集中于免疫反應、細胞凋亡、抗增殖等生物學功能中。在對細胞因子導致的激素抵抗體外模型中，Tliba等［11］研究發現，ASMCs短期暴露于TNF-α和IFN-γ導致糖皮質激素反應單位依賴的基因轉錄廢止，從而抑制皮質醇抗炎作用，在ASMCs暴露于TNF-α和IFN-γ后，氟替卡松可抑制TNF-α誘導的IRF-1表達、IRF-1 DNA結合及交連的能力完全喪失，提高細胞內IRF-1水平可導致類固醇功能喪失，而通過siRNA法減少細胞內IRF-1水平可恢復類固醇功能，說明IRF-1在介導激素抵抗方面起到重要作用，是介導皮質醇耐藥的又一新的機制。本實驗證實在肥胖大鼠較正常體質量大鼠ASMC中 IRF-1的水平明顯升高，肥胖哮喘大鼠ASMC中IRF-1的水平較其他組明顯升高，且瘦素干預后ASMC中各組細胞IRF-1蛋白表達量均分別較相應的NS干預組的蛋白表達量明顯增加，為肥胖哮喘ASMC中IRF-1的高水平表達在激素抵抗中的作用提供了理論依據。

綜上所述，肥胖哮喘大鼠ASMC表達OB-R及IRF-1均明顯高于正常體質量哮喘大鼠或肥胖對照組，瘦素干預后，ASMC中各組細胞IRF-1蛋白表達量均分別較相應的NS干預組的蛋白表達量明顯增加，提示瘦素通過OB-R促進IRF-1在肥胖哮喘大鼠ASMC中的表達可能是參與肥胖哮喘發生激素抵抗的重要原因，推測瘦素可能成為肥胖哮喘激素抵抗治療的新靶點。

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