熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌中MTA1和E-cadherin的表達及意義

梁祥森，陳銘伍，冼 磊

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

MTA1基因是腫瘤轉移相關蛋白家族(MTA)的成員之一，通過調控一系列與浸潤轉移有關的蛋白，在癌細胞侵襲和轉移過程中發揮重要作用，而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)為鈣依賴性黏附蛋白家族中的重要成員之一，是與浸潤轉移有關的蛋白之一，它在上皮性惡性腫瘤中最重要的生理功能就是抑制腫瘤細胞脫落后發生轉移，其表達的缺失或減低可能與人癌細胞的去分化、侵襲性和轉移傾向有關。MTA1有可能通過對E-cadherin的調節，從而在癌細胞的侵襲和轉移過程中發揮作用。本研究采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)聯合檢測40例非小細胞肺癌(NSCLC)組織、12例癌旁組織、12例良性病變肺組織中MTA1和E-cadherin基因表達的相對水平，分析其表達與臨床和組織病理學特征的關系，探討MTA1和E-cadherin在NSCLC中對腫瘤的發生、侵潤、轉移方面作用的可能機制，分析二者的關系，尋求一種新而有效的檢測方法來提高肺癌的早期檢出率，提高患者生存率。

1 材料與方法

1.1 材料 取我院2010年7月～2011年1月手術切除的NSCLC標本40例，所有病例術前未行放療和化療;另取其中12例癌旁組織、12例手術切除的良性病變肺組織(6例肺大皰、3例肺結核、3例炎性包塊)作為對照，全部標本收集后立即于－80℃冰箱保存，全部標本均經病理確診。逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，SYBR Green I熒光染料購自北京天根公司。熒光定量PCR儀為Step one V2.1(ABI公司)。引物由大連寶生物公司設計合成。MTA1(84 bp)F:5'-CAGCTACGAGCAGCACAACG-3';R:5'-TGTCCGTGGTTTGCCAGA-3'。E-cadherin(123 bp)F:5'-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3';R:5'-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3'。內參β-actin(116 bp)F: 5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3';R:5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3'。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA 按TRIzol裂解抽提法進行總RNA的提取。通過測 A260值檢測 RNA濃度，測A260/A280值檢測其純度。1%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.2.2 RT反應 按逆轉錄試劑盒提供的方法合成cDNA存放－20℃冰箱備用。

1.2.3 Q-PCR擴增 將PCR產物通過吸附柱式瓊脂糖DNA回收方法進行回收純化，測定其濃度，制備標準品，再以10倍系列梯度進行倍比稀釋，獲得6個濃度梯度的標準品，依次進行PCR擴增，由儀器軟件自動繪制標準曲線。熒光染料SYBR Green I法進行PCR擴增，每份標本重復3次。反應體系20 μL:SYBR Green I 10 μL，10 pmol/μL的引物上、下游各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O補足體系。反應條件:95℃預變性2 min，然后95℃ 20 s、60℃ 30 s、68℃ 45 s共40個循環。內參β-actin與目的基因MTA1和E-cadherin反應體系及反應條件均相同。擴增完成后按儀器默認條件進行溶解曲線分析。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR產物長度符合目的基因引物設計長度，PCR產物經測序確認與目的基因的目的片段cDNA序列一致。通過PCR擴增曲線判定結果是否是陽性，溶解曲線可判斷其特異性，標準曲線產生擴增效率，利用檢測到的各個樣本MTA1和E-cadherin以及β-actin mRNA相對表達量，標化計算各樣本數據，以β-actin mRNA的模板量為參照，分別計算MTA1和E-cadherin mRNA的相對模板數，即:MTA1/β-actin和E-cadherin/β-actin，可依次分別得到每個標本MTA1和E-cadherin相對β-actin的模板數。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行分析，Q-PCR的計量資料采用±s表示。多組均數比較采用單因素方差分析;兩樣本均數比較，方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊時行秩和檢驗。相關性分析用Pearson線形相關檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 評價指標 目的基因MTA1和E-cadherin以及內參β-actin的擴增效率經各自的標準曲線自動生成，本實驗三基因擴增效率均為R2＞0.995。通過擴增曲線可以看到三者表達情況良好，而且在該反應條件下，三者擴增產物的溶解曲線均只有一個峰，具有很好的特異性，PCR產物均在大于84.0℃以上獲得單一溶解峰，確定為目的產物。

2.2 MTA1和E-cadherin在不同組織中的表達比較

MTA1 mRNA在NSCLC組織、癌旁組織、良性疾病組織平均表達水平分別為1.84±1.38、0.91± 0.24和0.56±0.29，MTA1 mRNA在NSCLC組織平均表達水平高于癌旁組織和良性疾病組織(P＜0.05)。E-cadherin mRNA在NSCLC組織、癌旁組織、良性疾病組織平均表達水平分別為9.97± 4.25、11.77±1.91和23.11±3.52，E-cadherin mRNA在NSCLC組織平均表達水平低于癌旁組織和良性疾病組織(P＜0.05)。在癌旁組織和良性疾病組織中MTA1和E-cadherin mRNA的表達無統計學差異(P＞0.05)。MTA1和E-cadherin mRNA表達水平與淋巴結轉移及臨床分期均有關(P＜0.05)，與患者年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度等均無關(P＞0.05)，見表1。

2.3 相關性分析 在NSCLC組織中MTA1和E-cadherin mRNA的表達呈負相關(r=－0.561，P＜0.01。

3 討論

目前未見采用實時熒光定量PCR聯合檢測MTA1和 E-cadherin mRNA水平的相關報道。大量相應的mRNA存在表達的增加，Q-PCR具有很高的敏感性和特異性，但本試驗所檢測到的各基因擴增效率并不相等，采用雙標準曲線相對定量方法進行檢測分析，避免了擴增效率不相等導致的實驗誤差，該法通過標準曲線獲取各基因的擴增效率，用β-actin管家基因作為內參照，以β-actin mRNA模板數作為標尺對實驗數據進行標化，利用CT值間接獲得目的基因MTA1和E-cadherin mRNA的相對模板數，從而獲得目的基因的真實表達水平。該方法可作為一種新而有效的早期檢測肺癌指標的實驗方法，從而提高肺癌的早期檢出率。

表1 MTA1及E-cadherin mRNA表達與肺癌臨床特征的關系

MTA1基因可能通過參與信號轉導與基因表達，調控一系列與浸潤轉移有關的蛋白而發揮作用。本實驗研究發現MTA1在NSCLC中平均表達水平明顯高于癌旁及良性疾病組織，結果與多數報道［1～3］一致，提示 NSCLC中 MTA1的高表達與NSCLC的發生發展呈正相關，MTA1的過度表達高度提示肺癌的發生。同時還發現NSCLC中淋巴結轉移組MTA1 mRNA的表達明顯高于無淋巴結轉移組，提示MTA1過度表達與NSCLC的轉移有關［1］。進一步對MTA1與肺癌的進展研究發現，MTA1的表達在Ⅲ期+Ⅳ期明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期，提示MTA1陽性表達與腫瘤進展及預后有關，晚期患者MTA1的表達水平較早期患者明顯升高，相關報道［4，5］亦指出MTA1陽性表達則預后差，生存期短，提示MTA1高表達與肺癌臨床分期呈正相關。本試驗結果還提示MTA1在NSCLC組織中的表達與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度、病理類型等無關，與多數文獻［1，2，5］一致。但Xu等［6］研究發現在NSCLC中MTA1的表達與吸煙密切相關，本實驗未能發現MTA1表達與吸煙的關系，可能與樣本例數較少、調查誤差及所選擇的樣本不具有代表性有關，有待加大樣本量進一步驗證。此外張華等［4］研究發現MTA1蛋白陽性表達率與腫瘤分化程度具有相關性，腫瘤分化程度越低，MTA1蛋白陽性表達率越高。本實驗檢測的mRNA基于基因水平，而大多數的基因發揮作用是通過蛋白的表達，從mRNA到蛋白中間翻譯、修飾的過程中可能造成mRNA/蛋白水平倒置。本實驗未能發現MTA1與腫瘤分化程度的相關性，可能與此有關。

E-cadherin與腫瘤的進展、淋巴結轉移及預后密切相關。本研究發現E-cadherin在NSCLC中平均表達水平明顯低于癌旁及良性疾病組織，結果與多數文獻報道［7～9］一致，提示E-cadherin表達的下調或缺失與腫瘤的發生和浸潤呈負相關。同時研究發現淋巴結轉移組E-cadherin mRNA的表達明顯低于無淋巴結轉移組，提示E-cadherin缺失或低表達與NSCLC的轉移密切相關。亦有報道［7］指出在NSCLC中E-cadherin缺失或低表達似乎可提示淋巴結的微轉移。進一步研究發現，E-cadherin mRNA的表達在Ⅲ期+Ⅳ期明顯低于Ⅰ期+Ⅱ期，提示E-cadherin缺失或低表達與肺癌臨床分期呈負相關，晚期患者MTA1的表達水平較早期患者降低［7］。相關文獻［10］指出隨著肺癌組織分化程度升高，E-cadherin表達增強，分化越低的肺癌E-cadherin陽性越弱，甚至不表達。而Lin等［11］報道E-cadherin在鱗癌中的表達低于腺癌，提示E-cadherin的異常表達與病理類型有關。本研究未能發現E-cadherin異常表達與肺癌病理類型及分化程度的關系，可能與研究樣本量較少和病例的選擇不具代表性有關。

MTA1基因通過調控一系列與浸潤轉移有關的蛋白，從而在癌細胞侵襲和轉移過程中發揮重要作用，而E-cadherin是與浸潤轉移有關的蛋白之一，其表達的缺失或減低可能與人癌細胞的去分化、侵襲性和轉移傾向有關，MTA1有可能通過對E-cadherin的調節發揮作用，但目前未見有關二者相互關系以及調節機制的相關報道。本研究結果提示MTA1和E-cadherin呈負相關，二者相互協調的可能在NSCLC的發生、侵潤、轉移方面起著重要的作用，但調節機制仍有待于進一步研究。

綜上所述，本研究已驗證了肺癌組織中MTA1和E-cadherin與肺癌發生發展的密切關系，二者可能存在著負相關。聯合檢測NSCLC中MTA1和E-cadherin的表達，可用于NSCLC的輔助診斷以及預后評估，但MTA1與E-cadherin之間是否具有調控關系有待于進一步研究。

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