結(jié)腸癌組織CD133表達(dá)變化及意義

柯 金，胡喜梅，周水陽，包維鶯，范燕琴，陸 翠，朱銳鋒，王恒石，劉 媛

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院，上海201600)

最近研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中存在具有自我更新特性的細(xì)胞亞群即腫瘤干細(xì)胞，是引發(fā)腫瘤并維持其生長的根源，并在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起著決定性作用［1～5］。但結(jié)直腸癌組織中有無腫瘤肝細(xì)胞尚不明確。2011年8～11月，我們檢測了60例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Ki67、survivin。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年6月～2011年6月本院和上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)院收治的60例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌根治術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本。其中男26例，女34例;平均年齡64歲。結(jié)腸癌34例、直腸癌26例;高分化腺癌10例、中分化腺癌43例、低分化腺癌7例;pTNM分期Ⅰ期11例、Ⅱ期20例、Ⅲ期26例、Ⅳ期3例。患者術(shù)前均未行放化療。

1.2 CD133和Ki67、survivin檢測方法 采用Envi-sion兩步法檢測標(biāo)本中 CD133、Ki67、survivin的表達(dá)。標(biāo)本用石蠟包埋，制成4～5 μm厚切片;脫蠟、梯度水化;切片置于pH值為6.0檸檬酸緩沖液中進(jìn)行煮沸處理10 min，室溫冷卻，PBS漂洗;分別滴加一抗CD133多克隆抗體、Ki67單克隆抗體、survivin單克隆抗體，37℃孵育1 h，PBS沖洗;加適當(dāng)比例稀釋的二抗，37℃孵育20～30 min，PBS沖洗;DAB顯色;蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，干燥，中性樹膠封片;顯微鏡觀察。以PBS替代一抗作為空白對(duì)照，以已知陽性切片為陽性對(duì)照。

每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值定義為該細(xì)胞的陽性細(xì)胞百分比。CD133為跨膜蛋白，定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，survivin定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，Ki67定位于細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃色高出背景色為陽性細(xì)胞。由于CD133陽性細(xì)胞數(shù)量較少，先在低倍光學(xué)顯微鏡下(×100)尋找細(xì)胞陽性區(qū)域，然后在高倍鏡下計(jì)數(shù)CD133陽性細(xì)胞數(shù)，其中無陽性細(xì)胞表達(dá)者定義為陰性(－)，有陽性細(xì)胞表達(dá)者定義為陽性(+)。survivin陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為表達(dá)陰性(－)，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為表達(dá)陽性(+)。Ki67標(biāo)記指數(shù)(Ki67 LI)以陽性細(xì)胞百分率表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Person法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CD133主要定位于腫瘤細(xì)胞的腺腔面細(xì)胞膜，形成膜染色的環(huán)狀結(jié)構(gòu);少數(shù)可見單個(gè)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染色。CD133陽性腫瘤細(xì)胞在結(jié)直腸癌中呈非均勻分布，通常聚集在一個(gè)或相鄰的幾個(gè)癌巢中，且僅僅限于與腺腔直接接觸的腫瘤細(xì)胞。在CD133陽性腺腔中的脫落細(xì)胞，通常CD133表達(dá)呈陽性。本組30例(50%)CD133陽性表達(dá)。CD133表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)(P＜0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及大小、侵襲深度無關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

本組survivin陽性26例(43.3%)，Ki67 LI≥50%者41例(68.3%)。survivin僅與結(jié)直腸癌組織的病理分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)，Ki67 LI與各項(xiàng)臨床病理參數(shù)無關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

相關(guān)分析結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中CD133與survivin、Ki67呈正相關(guān)(r分別為0.269、0.466，P均＜0.05);survivin與Ki67呈正相關(guān)(r為0.378，P＜0.01)。

3 討論

表1 結(jié)直腸癌組織中CD133、survivin、Ki67與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腫瘤是由體細(xì)胞經(jīng)過一系列隨機(jī)的多基因突變而成，突變后細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)、凋亡基因沉默，使的每個(gè)腫瘤細(xì)胞都可以無限制地生長。與此相反，近年來的研究卻顯示并非所有的腫瘤細(xì)胞都有相同的增殖潛力，僅有極少數(shù)稱之為腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞具有廣泛增殖、自我更新和多向分化的能力。

CD133又稱Prominin-1，含5個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)胞外區(qū)的糖蛋白，是Prominin家族中的一員，最初作為造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志物［6］。2007年O'Brien等［7］發(fā)現(xiàn)CD133可作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。將從7例結(jié)腸癌原發(fā)灶和10例轉(zhuǎn)移灶中分離的CD133陽性腫瘤細(xì)胞接種于NOD/SCID鼠腎被囊中，發(fā)現(xiàn)CD133陽性細(xì)胞可以起始腫瘤，而CD133陰性細(xì)胞不具有起始腫瘤的作用。由于CD133陽性細(xì)胞具有自我更新及分化、增殖能力，故認(rèn)為CD133陽性細(xì)胞即結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞。同樣在 WIDR、SW480、HSC15、CCK81等12株結(jié)腸癌細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞的存在［8］。目前CD133是多種腫瘤干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)標(biāo)志物之一，但其具體功能尚待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌標(biāo)本中CD133陽性表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期和病理分級(jí)顯著相關(guān)，即腫瘤組織中CD133陽性細(xì)胞越多，其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性就越大，腫瘤的侵襲能力和惡性程度就越高，患者的術(shù)后生存時(shí)間可能就越短。提示腫瘤組織中CD133陽性細(xì)胞越多，腫瘤干細(xì)胞就越多，術(shù)后殘留的腫瘤干細(xì)胞通過自我更新和多向分化，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。同樣，大量研究顯示CD133可作為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，CD133表達(dá)與患者的無復(fù)發(fā)生存和總生存率呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤的進(jìn)展和肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［9～11］。

survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)的分子量最小，對(duì)凋亡的抑制作用最強(qiáng)的IAP。基因長度為14.7 kb，定位于染色體17q25，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。survivin具有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能，通過抑制內(nèi)源性和外源性凋亡途徑細(xì)胞色素C和Caspase-8誘導(dǎo)的Caspases活化，或直接同Caspase-3和Caspase-7結(jié)合使級(jí)聯(lián)終止，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制。研究顯示survivin在人類多種腫瘤組織中過表達(dá)，而在成人正常分化的組織中很少表達(dá)，并且survivin的表達(dá)與惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、化療耐藥性及預(yù)后相關(guān)［12］。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中survivin表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)密切相關(guān)，并且和CD133表達(dá)正相關(guān)，提示survivin的過表達(dá)可能在腫瘤干細(xì)胞的化療抵抗性中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)的惡性膠質(zhì)瘤中，耐藥性和放療抵抗性的增加是由于腫瘤干細(xì)胞的BCRP1、MGMT和survivin表達(dá)增強(qiáng)所致［13］。

Ki67是一個(gè)和細(xì)胞增殖有關(guān)的核抗原，Ki67蛋白是一種分子量為345、395 kd的雙鏈非組蛋白分子。Ki67存在于細(xì)胞周期的G1后期、S、G2、M期，而不存在靜止的G0細(xì)胞。Ki67表達(dá)能可靠而迅速的反映惡性腫瘤增殖率，與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)，是應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)志之一。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中CD133和survivin的表達(dá)與Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示腫瘤干細(xì)胞數(shù)量越多，腫瘤增殖率越高。國內(nèi)唐畢鋒等［14］用RT-PCR檢測38例手術(shù)切除的胃癌原發(fā)組織中CD133mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD133mRNA的表達(dá)與Ki-67表達(dá)密切相關(guān)。李亞卓等［15］應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測336例胃癌術(shù)后標(biāo)本中CD133和Ki-67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。

總之，結(jié)直腸癌中CD133陽性細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)對(duì)判斷結(jié)直腸癌的惡性程度和預(yù)后具有積極的臨床意義。

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