石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測定油茶籽中的苯并（α）芘的研究

莫潤宏，湯富彬，丁 明，屈明華，倪張林，沈丹玉，鐘冬蓮

（中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，國家林業局經濟林產品質量檢驗檢測中心，浙江 富陽 311400）

苯并（α）芘屬多環芳烴類物質，由5個苯環構成，具有強致癌作用，且其化學性質穩定，不易降解，易積累，有較大的潛在危害。苯并（α）芘廣泛存在于肉類食品、熏烤食品和食用油中，國家標準GB2762-2005和GB2716-2005中規定了熏烤肉和糧食中的苯并（α）芘的限量為5 μg/kg，食用油中的苯并（α）芘的限量為10 μg/kg[1-2]。油茶籽油以其豐富的不飽和脂肪酸、維生素E和微量礦質元素等受到人們青睞[3]，但油茶籽油苯并（α）芘超標事件給我國茶油市場和產業帶來了不小的影響。目前，對于油茶籽油加工技術、營養指標及安全指標的研究較多[4-7]，但對作為原料的油茶籽關注薄弱。炒制后的油茶籽能提高初榨時的出油率，但炒制時的高溫無疑引入了產生苯并（α）芘的潛在風險[8]，而苯并（α）芘良好的脂溶性將使其比較容易從油茶籽轉移到油茶籽油中，直接影響油茶籽油食用安全。

據報道，有關苯并（α）芘的檢測方法主要有：比色法、高效液相色譜法、氣質聯用法和液質聯用法等[9-12]，凈化方法主要由GPC法、中心氧化鋁SPE凈化法等[13-14]。油茶籽樣品不同于一般低脂樣品（如一般肉類樣品、蔬菜樣品），基質簡單；也不同于食用油脂樣品，以均一穩定的液體形式存在，性質穩定。油茶籽樣品含油量高，還含有色素等其他物質，基質復雜，這給樣品前處理及檢測帶來很大難度。本文提出了一種石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測定油茶籽中苯并（α）芘的方法，該法重現性好、靈敏度高、操作簡單、結果準確。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695液相色譜儀配熒光檢測器（美國waters公司），萬分位分析天平（梅特勒，上海），恒溫水浴鍋（科導，上海），超聲清洗器（科導，上海），超純水儀（Milli-Q，美國），旋轉蒸發儀（Buchi，瑞士），均質器（IKA，德國）。

石油醚（沸程60～90℃），無水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，TEDAI，美國）。

苯并（α）芘（甲醇）標準品：20 μg/mL（國家標物中心）。

1.2 前處理方法

1.2.1 提 取 稱取粉碎后的油茶籽試樣25.00 g（精確至0.01 g）于250 mL磨口平底燒瓶中，加100 mL石油醚，用均質器均質2 min后，超聲提取30 min，取出，裝上旋轉蒸發儀（45℃）揮發至干。

1.2.2 凈 化 在提取完的磨口平底燒瓶中加入100 mL 2 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，85℃水浴冷凝回流皂化1 h，取出冷卻。將皂化液通過塞有棉花的漏斗，轉移至500 mL分液漏斗，加50 mL飽和氯化鈉溶液，加石油醚，萃取 3 次（50、50、30 mL）。合并萃取液于250 mL分液漏斗中，用超純水洗至中性。將石油醚相通過無水硫酸鈉濾入250 mL磨口平底燒瓶中，在50℃水浴條件下旋轉蒸發至干，加入2 mL乙腈清洗燒瓶內壁，復溶苯并（α）芘，過0.22 μm有機相膜待測。

1.3 色譜及檢測器條件

色譜柱：多環芳烴（PAH）C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm柱）；流動相：乙腈∶0.5%磷酸溶液（V/V，95∶5）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL[15]。熒光檢測器條件：激發波長384 nm，發射波長406 nm。

2 結果與討論

2.1 提取條件選擇

提取時選擇石油醚為提取劑，利用苯并（α）芘較強的脂溶性，將其從油茶籽中提出。油茶籽中的油脂也會隨即提出，有利于下步皂化。傳統提取方法主要通過索氏抽提法，提取時間一般為4～12 h，耗時較長。采用均質后，超聲輔助提取，能大大縮短提取時間，提取效果良好[16-17]。

2.2 凈化條件選擇

凈化油脂方法多采用GPC凈化和中性氧化鋁SPE柱凈化，但GPC凈化所用儀器昂貴，中性氧化鋁SPE柱在油脂含量較高時凈化作用不明顯。利用苯并（α）芘不溶于水且對酸堿穩定的性質，采用氫氧化鉀乙醇溶液皂化的方法，除去油脂，達到凈化目的。

2.3 方法學驗證

2.3.1 方法的定量下限（LOQ） 在空白樣品中，添加低濃度的標樣，按照峰面積信噪比大于10（S/N＞10）進行計算，得到苯并（α）芘的定量下限為0.1 μg/kg，滿足國標檢測限量要求。

2.3.2 標準曲線及線性范圍 準確吸取苯并（α）芘（甲醇）標樣1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2000 μg/mL苯并（α）芘母液。吸取母液0.5 mL于10 mL容量瓶中，氮氣吹干，用乙腈溶解定容，得100 μg/mL標準儲備液。分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL于10 mL容量瓶，用乙腈定容，得1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL 標準使用液。依次從低濃度到高濃度進樣20 μL，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。在1.0～20 μg/mL內線性良好，標準曲線方程：y=112 391 x+48 692，R2=0.999。

2.3.3 方法精密度和回收率 在空白樣品中，分別加入不同濃度的苯并（α）芘標準儲備液，按建立的提取凈化方法操作并檢測，選擇苯并（α）芘1.0、10、20 μg/kg 3個添加水平，計算苯并（α）芘平均回收率及相對標準偏差（n=6），見表 1。結果表明，在 1.0、10、20 μg/kg 3個添加水平時，苯并（α）芘的平均回收率為84.0%～94.0%，相對標準偏差在4.29%～8.26%間，準確度和精密度均達到殘留分析的要求。

表1 苯并（a）芘添加回收率試驗結果（n=6）

2.3.4 實際樣品測試 對實際炒焦的10批油茶籽樣品進行檢測，2批炒焦油茶籽樣品中檢出含有苯并（α）芘，含量分別為 0.32、0.64 μg/kg。標樣及樣品色譜圖見圖1。

圖1 苯并（α）芘標樣及油茶籽樣品檢測色譜圖

3 結論

本研究建立了一種石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測定油茶籽中苯并（α）芘含量的檢測方法。方法相對偏差為4.29%～8.26%，加標平均回收率為84.0%～94.0%，結果表明該方法精密度好，準確性高，檢測所用試劑成本低，操作簡單，完全適用于油茶籽中苯并（α）芘的測定。

[1]GB 2762-2005.食品中污染物限量[S].

[2]GB 2716-2005.食用植物油衛生標準[S].

[3]柏云愛，宋大海，張富強，等.油茶籽油與橄欖油營養價值的比較[J].中國油脂，2008，33（3）：39-41.

[4]鐘冬蓮，湯富彬，沈丹玉，等.油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測定[J].分析試驗室，2011，30（11）：104-106.

[5]費學謙.油茶籽油加工業現狀、問題及對策分析[J].食品工業科技，2011，32（10）：449-452.

[6]黃佳聰，陸 斌，闞 歡，等.騰沖紅花油茶籽油主要理化成分分析[J].西南林學院學報，2010，30（5）：29-32.

[7]倪張林，湯富彬，屈明華，等.濕法消解-石墨爐原子吸收光譜法測定山茶油中的鎘[J].中國無機分析化學，2011，1（3）：66-68.

[8]袁向星，杜京霖，寧 暉，等.油茶籽油中苯并（α）芘的產生[J].中國油脂，2008，29（5）：309-311.

[9]王 浩，劉艷琴，楊紅梅，等.高效液相色譜法測定糧食中苯并芘殘留的研究[J].糧油食品科技，2007，15（1）：53-54.

[10]趙恒強，陳軍輝，程紅艷，等.高效液相色譜-電噴霧銀離子誘導電離飛行時間質譜定性分析高沸點多環芳烴[J].分析化學，2010，38（11）：1599-1603.

[11]GB/T5009.27-2003.食品中苯并（α）芘的測定[S].

[12]畢鴻亮，張浩原，孫翠香，等.蔬菜中多環芳烴的GC-MS分析[J].分析測試學報，2007，26（4）：530-532.

[13]佟 玲，周瑞澤，吳淑琪，等.加速溶劑提取凝膠滲透色譜凈化氣相色譜質譜快速測定玉米中多環芳烴 [J].分析化學，2009，37（3）：357-362.

[14]GB/T22509-2008.動植物油脂苯并（α）芘的測定反相高效液相色譜法[S].

[15]湯富彬，莫潤宏，鐘冬蓮，等.皂化提取-高效液相色譜法測定油茶籽油中苯并（α）芘殘留[J].中國油脂，2012，37（2）：62-64.

[16]胡愛軍，馮棋琴，鄭 捷.超聲波強化提取油茶籽油的研究[J].中國油脂，2009，34（2）：17-19.

[17]周 倩，范成鋼，聶 蕓，等.超聲波輔助提取油茶籽油工藝條件研究[J].中國糧油學報，2011，26（5）：61-65.