隆回縣食用百合鱗莖腐爛病菌生物學(xué)特性及室內(nèi)防治藥劑篩選

朱海燕，夏 花，高必達(dá),2,3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.植物疾病控制與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.植物病蟲害生物與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

2011年在邵陽(yáng)隆回地區(qū)龍牙百合基地發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)期百合鱗莖腐爛病，受害鱗莖變褐腐爛，其病原經(jīng)鑒定確認(rèn)為尖孢鐮刀菌百合專化型（Fusarium oxysporum f.sp.lilii）[1]。該病對(duì)百合生產(chǎn)造成重大影響，大田發(fā)病率達(dá)40%～60%[2]。為進(jìn)一步了解該病菌病原特性，尋求最適防治方法，對(duì)該菌生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并對(duì)防治藥劑進(jìn)行了篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌為隆回縣科技局提供的發(fā)病鱗莖上分離得到的尖孢鐮刀菌百合專化型。供試藥劑有75%百菌清可濕性粉劑（陜西先農(nóng)生物科技有限公司），99%惡霉靈原藥（山東煙臺(tái)鑫潤(rùn)精細(xì)化工有限公司），5%己唑醇微乳劑（東莞市瑞德豐生物科技有限公司），10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（山東澳得利化工有限公司），50%代森錳鋅可濕性粉劑（先正達(dá)作物保護(hù)有限公司），50%福美雙可濕性粉劑（石家莊市綠豐化工有限公司），50%烯酰嗎啉水分散粒劑（鄭州先利達(dá)化工有限公司），嘧菌酯懸浮劑（山東禾木藥業(yè)有限公司），3%中生菌素可濕性粉劑（深圳諾普信農(nóng)業(yè)股份有限公司），12.5%烯唑醇可濕性粉劑（惠州市中訊化工有限公司），70%丙森鋅可濕性粉劑（深圳諾普信農(nóng)業(yè)股份有限公司），72%甲霜靈—錳鋅可濕性粉劑（江蘇高郵市豐田農(nóng)業(yè)有限公司），200 g/kg腈菌·福美雙（1∶9）可濕性粉劑（威海韓孚生化藥業(yè)有限公司）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 設(shè)置10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 和 40℃ 共 11 個(gè)不同溫度，將菌絲塊接于PDA平板中央，分別置于預(yù)設(shè)溫度的恒溫箱中培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑，7 d后測(cè)產(chǎn)孢量。

1.2.2 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 （1）pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配 制 pH 值 分 別 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的 PDA 培養(yǎng)基，每個(gè)處理 4次重復(fù)；將直徑為7 mm的菌餅接種于不同pH值的培養(yǎng)液中央，于25℃下恒溫培養(yǎng)。5 d后，菌落長(zhǎng)滿全皿時(shí)，將菌落移出來(lái)，用濾紙吸干后稱量鮮重，再烘干（65℃、24 h）稱干重，根據(jù)不同pH條件下增加的重量來(lái)比較其菌絲生長(zhǎng)速率。（2）pH值對(duì)菌落產(chǎn)孢的影響。配制 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0 的 PDA 培養(yǎng)基，將 7 mm菌絲塊接種于平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，7 d之后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.2.3 不同光照條件對(duì)病原菌產(chǎn)孢及菌絲生長(zhǎng)的影響 將7 mm的菌絲塊移入150 mL液體查氏培養(yǎng)基中，設(shè)置連續(xù)光照、12 h光暗交替、完全黑暗3種不同光照處理，在27℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d。每處理吸取1 mL菌懸液用無(wú)菌水稀釋10倍，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量；每處理再量取140 mL培養(yǎng)液用定量濾紙過(guò)濾孢子，用相同大小的濾紙作對(duì)照，80℃恒溫烘干至恒重，分別稱量干重，并計(jì)算菌絲量。

1.2.4 分生孢子致死溫度的測(cè)定 吸取1.2.3中光暗交替處理的菌懸液9 mL，過(guò)濾菌絲后吸取孢子懸浮液500 μL于薄壁的12個(gè)小離心管中；分別置于 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃的水浴鍋中水浴10 min；之后迅速置于冰上冰浴10 min；分別吸取100 μL不同溫度處理后的孢子懸浮液于PDA平板上，均勻涂板，每個(gè)溫度3次重復(fù)。25℃培養(yǎng)，5 d后觀察菌落形成情況。

1.2.5 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 以不加碳源的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入含等量碳源的果糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇，以配成不同碳源培養(yǎng)基，無(wú)碳源培養(yǎng)基作為對(duì)照；同法以含等量氮源的硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、肌氨酸、天冬氨酸配置不同氮源的培養(yǎng)基，以無(wú)氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。以7 mm菌絲塊接于不同碳源或氮源培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑，7 d后測(cè)定菌落產(chǎn)孢量。

1.2.6 殺菌劑的室內(nèi)篩選 采用含毒介質(zhì)法進(jìn)行病原菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)。取直徑7 mm的菌餅接種到事先配制的含藥培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，以無(wú)菌水為對(duì)照。每隔1天觀察一次，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。根據(jù)菌落平均直徑求得各藥劑抑菌率，采用DPS V7.0軟件對(duì)藥劑濃度、抑菌率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求得各殺菌劑毒力回歸方程及EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

從圖1中可以看出，該菌可在10～36℃溫度下生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度為25～31℃，28℃時(shí)菌落生長(zhǎng)最快；超過(guò)28℃，隨著溫度的升高，菌落直徑不斷減小。從產(chǎn)孢量來(lái)看，不同溫度對(duì)產(chǎn)孢量影響較大，13～36℃下菌落均能產(chǎn)生孢子，28～35℃為最適產(chǎn)孢溫度，34℃時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)到最大。

圖1 溫度對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型菌絲生長(zhǎng)（5 d）及產(chǎn)孢（7 d）的影響

2.2 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

從圖2中可以看出，菌落在pH值為4～12時(shí)均能生長(zhǎng)，菌落菌絲凈重在pH為5時(shí)達(dá)到最大。這表明：菌落在中性偏酸和堿性的環(huán)境都能生長(zhǎng)，在弱酸性環(huán)境下菌絲凈重增長(zhǎng)最快，弱酸性環(huán)境中更有利于菌落生長(zhǎng)。pH值對(duì)菌落產(chǎn)孢量的影響呈現(xiàn)雙峰曲線，在中性偏酸（pH=6）或中性偏堿（pH=9）環(huán)境中更有利于該菌產(chǎn)孢。酸性環(huán)境下產(chǎn)孢量下降得更快，表明偏堿性環(huán)境中更有利于產(chǎn)孢。

圖2 pH值對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型生長(zhǎng)（5 d）及產(chǎn)孢（7 d）的影響

2.3 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

從表1中可以看出，光照對(duì)菌絲會(huì)產(chǎn)生一定的影響，以交替光照條件下菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況最佳，全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況最差。這說(shuō)明交替光照條件下，有利于尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢；全黑暗條件對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最不利。

表1 光照對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型生長(zhǎng)（5 d）及產(chǎn)孢（5 d）的影響

2.4 分生孢子致死溫度的測(cè)定

分生孢子經(jīng)不同溫度處理后，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌落個(gè)數(shù)有較明顯差別。根據(jù)是否長(zhǎng)出菌落，了解分生孢子的存活情況。結(jié)果表明，低于52℃處理，菌落可以生長(zhǎng)，52℃或超過(guò)52℃處理不產(chǎn)生菌落。因此，判定該菌致死溫度為52℃。

2.5 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

2.5.1 碳源對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型的影響 從表2中可以看出，尖孢鐮刀菌百合專化型在果糖等8種碳源中均能生長(zhǎng)。其中，在果糖、蔗糖中，生長(zhǎng)最好；在半乳糖，α-乳糖中生長(zhǎng)最差。在無(wú)碳培養(yǎng)基中，菌絲能生長(zhǎng)，但菌絲較稀薄。尖孢鐮刀菌百合專化型在果糖等7種碳源中均能產(chǎn)孢子。其中，葡萄糖、果糖產(chǎn)孢量最大，分別達(dá)到3.825×107個(gè)/皿、2.925×107個(gè)/皿；在半乳糖、麥芽糖中產(chǎn)孢量最小，分別為 6.45×106個(gè)/皿、7.80×106個(gè)/皿。在無(wú)碳培養(yǎng)基中不產(chǎn)孢。

表2 碳源對(duì)尖孢鐮刀菌百合轉(zhuǎn)化型菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.2 氮源對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型的影響 從表3中可以看出，尖孢鐮刀菌百合轉(zhuǎn)化型在L-精氨酸、硫酸銨、L-脯氨酸、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸、無(wú)氮培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。其中，在天冬氨酸、L-脯氨酸中，菌落直徑最大；在硫酸銨、甘氨酸中，菌落直徑最小。在無(wú)氮培養(yǎng)基中，菌絲能生長(zhǎng)，但菌絲較稀薄。尖孢鐮刀菌百合轉(zhuǎn)化型在L-精氨酸、硫酸銨、L-脯氨酸、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸中均能產(chǎn)孢。其中，硝酸鉀的產(chǎn)孢量最多，達(dá)到7.507 5×108個(gè)/皿；其次是 L-酪氨酸，達(dá)到 8.527 5×107個(gè)/皿；在硫酸銨中產(chǎn)孢最少，只有6.75×105個(gè)/皿。在無(wú)氮培養(yǎng)基中不產(chǎn)孢。

表3 氮源對(duì)尖孢鐮刀菌百合轉(zhuǎn)化型菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

2.6 殺菌劑的室內(nèi)篩選

為了解各殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的作用，試驗(yàn)測(cè)定了75%百菌清WP等13種常用殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的EC50值，結(jié)果如表4。13種殺菌劑的EC50值大小順序?yàn)椋?2%甲霜靈-錳鋅>50%烯酰嗎啉>70%丙森鋅>嘧菌酯>50%代森錳鋅>50%福美雙>75%百菌清>99%惡霉靈>3%中生菌素>5%己唑醇>10%苯醚甲環(huán)唑>腈菌·福美雙>12.5%烯唑醇。其中，12.5%烯唑醇WP、腈菌·福美雙WP、10%苯醚甲環(huán)唑WG、5%己唑醇ME、3%中生菌素WP抑制病菌菌絲生長(zhǎng)效果最好，EC50分 別 為 1.080 4、2.228 4、2.616 2、5.121 2、16.192 0 mg/L。75%百菌清WP、99%惡霉靈DP、50%福美雙WP抑菌效果次之，EC50分別為70.780 9、62.958 2、71.270 9 mg/L。50%代森錳鋅 WP、70%丙森鋅、50%烯酰嗎啉WG、72%甲霜靈-錳鋅WP效果最差，EC50分別為 216.149 0、611.299 7、830.275 5、4 614.198 4 mg/L，遠(yuǎn)高于其他藥劑的EC50。

表4 不同殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型菌株的毒力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

3.1 百合鱗莖腐爛病的生物學(xué)特性

對(duì)尖孢鐮刀菌百合專化型生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28℃，產(chǎn)孢最適溫度為34℃；孢子致死溫度為52℃；pH在4～12的范圍內(nèi)該菌均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，pH值為5時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，pH值為6時(shí)產(chǎn)孢量最大；交替光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢最好；在供試碳源中，菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢均以果糖最好；在供試氮源中，天冬氨酸最利于菌絲生長(zhǎng)，硝酸鉀最利于產(chǎn)孢。這些結(jié)論與朱茂山[3]、李曉琴[4]等對(duì)尖孢鐮刀菌生物學(xué)特性研究報(bào)道基本一致，但在最適pH值、光照影響等方面存在一定的差異。

3.2 室內(nèi)藥劑的篩選

試驗(yàn)中苯醚甲環(huán)唑、惡霉靈、腈菌·福美雙、代森錳鋅、丙森鋅、烯酰嗎啉、甲霜靈-錳鋅的抑菌效果與梁巧蘭等對(duì)尖孢鐮刀菌藥劑防治研究的結(jié)果基本一致[5-8]。其中抑菌效果最好的烯唑醇、腈菌·福美雙、苯醚甲環(huán)唑、己唑醇均屬于三唑類殺菌劑。三唑類殺菌劑是一類重要的內(nèi)吸性殺菌劑，其用于尖孢鐮刀菌的防治的報(bào)道還不多見，僅在安智慧等[6]對(duì)百合鐮刀菌枯萎病防治藥劑的研究中首次提到三唑類殺菌劑對(duì)百合枯萎病防治效果好。該試驗(yàn)通過(guò)進(jìn)一步研究，驗(yàn)證了三唑類藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的防治效果。

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