圓葉無心菜的組織培養技術研究

方其仙，祖艷群，李 元

（1.云南農業職業技術學院，云南 昆明 650031；2.云南農業大學資源與環境學院，云南 昆明 650201）

圓葉無心菜（Arenaria rotumdifolia Bieberstein）為石竹科（Caryophyllaceae）石竹目植物，分布較廣，在海拔2 300～3 600 m的地區，如云南會澤、大理、洱源、鎮康、麗江、維西、德欽等地都有生長。圓葉無心菜莖側被短柔毛，其葉圓形或卵圓形；花瓣短于萼片，一年生或多年生野生植物，葉對生，花白色，排成頂生的聚傘花序；萼片5；花瓣5；常全緣，很少缺；蒴果卵球形或長圓形。

在云南會澤鉛鋅礦區，圓葉無心菜能頑強生長，經研究發現是Pb的一種超累積植物。但至還未見今國內外報道圓葉無心菜的人工繁育和栽培技術，且很難采到其種子。因此，通過組織培養技術，對圓葉無心菜的無性系進行研究，以期解決礦區植物所需大量種苗供應問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以野生植物圓葉無心菜的頂芽和嫩莖為外植體。基本培養基選用MS，根據培養要求，添加不同濃度的細胞分裂素（6-BA）、生長素（NAA）。培養基pH值為5.8，蔗糖3%，瓊脂為7 g/L，誘導生根的培養基用MS，蔗糖2%，微量元素適當降低。培養基在高壓滅菌鍋中 0.1×1012～0.101×1012Pa 氣壓下保持20 min滅菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷誘導 將小苗在自來水下沖洗10～20 min后，在接種室用70%的酒精浸泡消毒30 s，用10%NaClO消毒8～10 min，再用無菌水反復沖洗3次，在無菌條件下切取0.4～0.6 cm的頂芽和嫩莖，接種到誘導愈傷組織的培養基中。培養溫度（25±2）℃，光照強度 1 600～2 400 lx，光照時間 12 d。培養30 d后，觀察其愈傷組織的形成情況。

1.2.2 不定芽分化 將形成的愈傷組織接種到添加不同濃度的6-BA、NAA的MS培養基上，進行芽分化培養，30 d后觀察統計不定苗長出的葉片數量、莖高、莖粗，觀察其長勢。

1.2.3 不定芽生根 將分化培養基中生長良好的不定苗，接種到MS或1/2 MS附加不同濃度6-BA、NAA的生根培養基中培養30 d時統計。

1.2.4 煉苗與移栽 試驗在組培苗出瓶前2 d把瓶蓋打開，其中20%完全去掉瓶蓋，其余保持瓶蓋半遮瓶口，2 d后將組培苗從瓶口取出，用清水洗凈根部所沾的培養基，再用1‰KMnO4溶液浸泡30 s（防止根系腐爛），濾干后移栽到經高溫滅菌的基質（珍珠巖∶沙土=1∶2）中，然后置于溫室中 15 d，統計移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 圓葉無心菜愈傷組織的誘導

由表1可見，不同濃度的生長素對圓葉無心菜愈傷組織的誘導具有不同的影響。添加0.2 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA時，愈傷組織形成率達85%。該培養基誘導出的愈傷組織顏色嫩綠，外形光滑、較軟，呈顆粒狀，這樣的愈傷組織具有分化能力。這表明MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L是誘導圓葉無心菜形成具有分化能力的愈傷組織較理想的培養基配方。

表1 不同濃度的生長素對圓葉無心菜愈傷組織的誘導影響

2.2 不同濃度激素對愈傷組織分化的影響

從表2中可以看出，這幾種培養基都可以誘導分化出不定芽，但分化率不一樣，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基上，整個愈傷組織塊上都布滿了分化芽，平均每塊愈傷組織可分化出9.90個不定芽，而且分化苗的長勢也較好。因此，該培養基是誘導圓葉無心菜愈傷組織芽分化的理想培養基。

表2 不同濃度生長素對不定芽分化的影響

2.3 不同濃度激素對分化芽生長的影響

雖然愈傷組織在這幾種培養基中都能誘導出分化芽，且數量也較多，但分化芽的長勢不一樣，30 d時觀察結果見表3。由表3可見，幾種培養基中，不定芽在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基中長勢最好。因此，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是圓葉無心菜不定芽生長的理想培養基。

表3 不同濃度激素對分化芽生長的影響

2.4 不同濃度生長素對組培苗不定根生長的影響

由表4可見，組培苗在MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中生根率達11.70/株，接種一個星期后即可形成可見根，并且根系生長速度快，長勢好。

表4 不同濃度生長素對組培苗不定根生長的影響

2.5 煉苗及移栽

20%小苗完全去掉瓶蓋，1 d內即萎蔫，其余小苗煉苗2 d后經清潔處理，栽到經高溫滅菌的基質，溫室中栽培15 d，成活率也很低，只有10%。

3 討論

3.1 外植體的消毒

試驗得知，最適合圓葉無心菜的消毒方法是：自來水沖洗干凈，70%酒精浸泡30 s，10%NaClO消毒8～10 min，再用無菌水沖洗3次，如果浸泡時間不夠，內部病毒難以滅凈，會在1～2個星期以后出現污染，如果浸泡時間過長，則會引起外植體失綠而死亡。

3.2 污染苗的消毒再利用

試驗過程中發現，長出叢生芽后，培養基出現污染跡象，并逐漸向上蔓延；還有一種現象：一瓶內多個外植體，只一個污染。暫把這些情況下培養瓶內還未被污染的外植體或小苗統稱為準污染苗。試驗表明：不經消毒，直接在無菌條件下轉接準污染苗仍繼續污染；若把準污染苗用酒精浸泡15 s，然后用無菌水沖洗干凈，再轉接可以正常生長。

3.3 煉苗及移栽

組培苗出瓶后，為適應外部環境，有一個煉苗的過渡階段。從煉苗到移栽這一階段，成活率很低，其原因可能是：①叢生芽轉接直接誘導生根，小苗太弱，出瓶后適應力差；②有的組培苗根部移栽時帶有愈傷組織，影響小苗生長；③出瓶操作不細致，若在生根液中浸泡1 min，再移栽，可提高成活率；④置于溫室后可能溫濕度控制不夠、波動過大、管理不善所致。

4 小結

（1）以頂芽和帶節的嫩莖為外植體，在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L能較好的誘導出愈傷組織。

（2）培養基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L芽的分化有較好的效果，平均每塊愈傷組織可分化出9.90個不定芽，且分化苗的長勢也較好。

（3）在培養基MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L中生根效果較好，生根率達11.7/株，接種一個星期后即可形成可見根，并且根系生長速度快，長勢好。

[1]夏海武，萬永霞，趙月玲.香石竹的脫毒快繁研究[J].昌濰師專學報，1999，18（5）：16-18.

[2]王淑芬，衣彩潔.霞草的組織培養[J].北京工業大學學報，1999，25（1）：68-71，81.

[3]寧淑香，張明宇，張洪英，等，羽衣甘藍無性系的建立[J].遼寧大學學報，2002，29（4）：375-381.

[4]周 音，張智奇，王少鷗，等，十字花科植物轉基因技術研究進展及存在問題[J].吉林農業大學學報，1996，18（1）：96-102.

[5]安利佳，姜長陽，植物組織培養導論[M].大連：遼寧師范大學出版社，1996.68-72.

[6]周國英，劉君昂，周德明.山崳菜組織培養的研究[J].中南林學院學報，2002，20（1）：65-67.

[7]邢 震，潘錦旭，鄭維列，等.藍玉簪龍膽莖段組織培養技術的研究[J].西藏植保，1999，87（5）：65-68.

[8]陳 敏，白書農.擬南芥菜培養經驗點滴[J].植物生理學通訊，1995，31（6）：436-438.