茶陵野生稻及其導入后代間的遺傳差異RAPD分析

蔣斌元，張 齊，康 敏，王勝利，龔建華，洪亞輝

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.株洲市農業科學研究所，湖南 株洲 412000）

水稻是一種重要的糧食作物，是人類主要的糧食來源，提高水稻產量以及防治病蟲害一直是科研工作者們努力的方向[1]。普通野生稻是栽培稻的近緣祖先，保有許多寶貴的基因資源，是水稻突破性育種與生產的重要基因源[2-4]。在茶陵已發掘的新石器時代大塘文化遺址中發現了已碳化的谷物堆，由此可見，茶陵地區谷物種植歷史悠久，茶陵野生稻具有重要的研究價值。湖南農業大學細胞生物學研究室與株洲農業科學研究所合作，將茶陵野生稻的基因組DNA采用花粉管通道法[5]導入受體栽培稻R9810、RCP08-29，其中R9810這一系中獲得的后代已培育到第4代，表型各異，表現出明顯的耐寒能力并且具有對株洲當地稻瘟病菌小種的抗性。筆者以茶陵野生稻及其導入后代為研究對象，輔以受體材料為對照，采用RAPD方法[6-9]研究總基因組導入后在遺傳上所造成的影響，旨在配合大田表型篩選，為后續有目的性地篩選試驗材料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為茶陵野生稻（W）、超級稻R9810（C）、 導入后代D4（1：ys09203；2：ys09004；3：ys090015；4：ys090026；5：ys090027c）

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取 將供試材料洗凈剪碎分別置于研缽中，加入液氮研磨破碎細胞，使用CTAB法[10]提取DNA，電泳檢測。

1.2.2 RAPD擴增 經過多次篩選確定使用引物（表1）與25 μL反應體系，PCR反應程序為94℃預變性 5 min；94℃變性 40 s，36℃復性 40 s，72℃延伸1 min，共計40個循環；最后72℃延伸7 min。引物濃度為10 μM。隨機引物由華大基因合成，利用隨機引物對各樣品基因組DNA進行擴增，凝膠電泳檢測擴增產物。

表1 RAPD隨機引物序列

1.2.3 數據分析 對凝膠電泳圖譜進行統計，使用統計類軟件NTSYSpc 2.1，基于非加權組平均法（UPGMA）對所得結果進行聚類分析[11-13]。

2 結果與分析

2.1 水稻基因組DNA的提取

提取的水稻基因組DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，顯示條帶清晰（圖1）。這說明所提取的水稻基因組DNA大分子較為完整，雜質和DNA的降解均比較少，符合RAPD所需要的PCR模板要求。經蛋白核酸測定儀測量，所提取的基因組DNA的A260/A280值為2.10，基本符合DNA的純度要求。

2.2 RAPD分析

用篩選出的18個RAPD隨機引物對各樣品基因組DNA進行擴增，圖2為部分RAPD電泳圖。

對顯示的凝膠電泳圖譜進行統計，使用1和0表示帶的有和無（表2）。使用統計類軟件NTSYSpc 2.1基于UPGMA算法對所得結果進行聚類分析，做出聚類圖（圖3）。基于該聚類圖所顯示的遺傳關系，發現茶陵野生稻總DNA經花粉管通道法導入栽培稻后，其導入后代在遺傳關系上表現各異，有仍然趨向于受體R9810的，如5號導入后代，也有隨機插入DNA片段后在遺傳距離上發生了改變的，如 1、2、3、4 號導入后代。

表2 隨機引物RAPD圖譜條帶讀取結果

3 討 論

采用花粉管通道法將茶陵野生稻的總基因組DNA導入栽培稻后，在表型上獲得了許多變異，筆者使用RAPD法在分子水平上對基因組導入所引起的變異進行了分析說明。研究結果表明，茶陵野生稻在進化上處于比較原始的位置，受體R9810與5號導入后代有著較近的親緣關系，5號材料在遺傳上并未出現很大的改變，而1、2、3、4號導入后代在遺傳上則受到了較大的改變，這些變化可能是由于DNA片段的隨機插入而引起，亦或者是僅限于所選引物進行擴增才會顯示的結果。總而言之，RAPD法能在某種程度上顯示出采用花粉管通道法將供體基因組DNA導入受體后所產生的后代在基因組水平的變化，能為后續選育試驗提供一定的參考。與表現型相結合，通過對花粉管通道法導入總DNA后獲得的大量后代進行歸類研究，能提高分類的準確性。

[1]康美花，曹豐生，陳紅萍，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進展及其在育種上的應用[J].江西農業學報，2010，22（2）：95-98.

[2]鄧啟云，袁隆平，梁鳳山，等.野生稻高產基因及其分子標記輔助育種研究[J].雜交水稻，2004，19（1）：6-10.

[3]盧寶榮，葛 頌，桑 濤，等.稻屬分類的現狀及存在問題[J].植物分類學報，2001，39（4）：373-388.

[4]呂學蓮，白海波，蔡正云，等.普通野生稻（Oryza rufipogon）DNA導入栽培稻后代的發芽耐鹽性研究 [J].安徽農業科學，2010，38（36）：20556-20558.

[5]龔蓁蓁，沈慰芬，周光宇，等.受粉后外源DNA導入植株技術-通過花粉管通道進入胚囊 [J].中國科學（B輯），1988，（6）：611-614.

[6]梁美霞，李景富，許向陽.RAPD技術在蔬菜遺傳育種上的應用[J].分子植物育種，2003，1（5-6）：737-740.

[7]許 麗，李明瑩，林 風.DNA分子標記及其在作物遺傳育種中的應用[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2006，24（4）：466-469.

[8]Mengoni A，Gori A，Bazzicalupo M.Use of RAPD and microsatellite（SSR）variation to assess genetic relationships among populations of tetraploid alfalfa[J].Medicago Sativa Plant Breeding，2000，119（4）：311-317.

[9]Ying X.Detection of Purity of Thai Hom Mali Rice by RAPD[J].Agricultural Science&Technology，2011，12（11）：1565-1568.

[10]Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J].Nucleic Acids Res，1980，（8）：4321-4325.

[11]薛慶中.DNA和蛋白質序列數據分析工具（第二版）[M].北京：科學出版社，2010.

[12]Nozaki T，Kumazaki A，Koba T，et al.Linkage analysis among loci for RAPDs，is ozymes and some agronomic traits in Brassica campestris L[J].Euphytica，1997，95：115-123.

[13]漆小泉，朱德蔚，沈 鏑，等.大白菜和紫菜薹自交染色體組DNA 的 RAPD 分析[J].園藝學報，1995，22（3）：256-262.