WADiana全自動配血系統進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗方法的建立*

李健 迭敏 周英 呂文彬

WADiana全自動配血系統進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗方法的建立*

李健①迭敏①周英①呂文彬①

目的：建立一種運用全自動微柱凝膠技術進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗的方法。方法：采用西班牙Grifols公司WADiana全自動配血系統編制試驗程序，通過全自動加樣以及孵育、離心等步驟進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗。結果：根據試驗需要，編制出兩種加樣程序，可以進行Rh(D)陰性確認和Rh(D)陰性確認+抗體篩選兩種試驗，通過20份已知Rh(D)血型鑒定和抗體篩選結果的標本，同時進行全自動微柱凝膠法以及試管法檢測，兩種方法檢測結果均一致。結論：利用WADiana全自動配血系統，可以采用全自動微柱凝膠技術進行Rh(D)陰性稀有血型確認試驗，提高實驗的自動化程度，確保實驗過程更標準化，實驗結果判讀更加客觀，并且可以通過微柱凝膠卡圖像拍攝達到實驗結果的保存信息化。

微柱凝膠技術； WADiana全自動配血系統； 獻血者； Rh(D)陰性確認試驗

Rh(D)陰性確認試驗是獻血者Rh血型鑒定中的重要試驗。通過該試驗可以檢出經IgM型抗-D試劑鑒定為陰性，但是用多個批次或廠家的IgM+IgG型或IgG型抗-D試劑進行間接抗球蛋白試驗鑒定出現部分或全部結果陽性的獻血者，這部分獻血者即為Rh(D)變異型，這種血液臨床應作為Rh(D)陽性血使用。

目前采供血機構進行獻血者Rh(D)陰性確認時，基本都采用試管法間接抗人球蛋白試驗，該方法加樣、孵育、生理鹽水洗滌、離心等步驟均為手工操作，最后由實驗操作者肉眼判讀結果，且實驗結果無法保存。微柱凝膠技術(MGIA)是1990年開始應用于紅細胞血型血清學臨床檢驗的，在經典抗人球蛋白試驗基礎上發展起來的新型檢測方法，在國外已成為常用紅細胞血型血清學檢測技術[1]，本實驗室根據微柱凝膠技術的優勢，結合WADiana全自動配血系統的功能和特點，建立了全自動微柱凝膠技術進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗的方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 西班牙Grifols公司WADiana全自動配血系統。

1.2 試劑 單克隆IgM+IgG抗-D抗體分別購自德國Biotes公司、加拿大Dominion公司、法國Diagast公司、英國Millipore公司(分別以 D1、D2、D3、D4表示)，IgG 抗 -D抗體(以D5表示)、抗人球蛋白試劑和抗體篩選細胞均購自上海血液生物醫藥有限公司，抗球蛋白微柱凝膠卡購自西班牙Grifols公司。

1.3 試驗方法編制和設計 根據Rh(D)陰性確認試驗的特點，其實質是間接抗人球蛋白試驗，試驗過程中孵育和離心的參數均與該儀器其他間接抗人球蛋白試驗(如交叉配血、抗體篩選)相同，僅僅是加樣的差異。Rh(D)陰性確認試驗是采用多個抗-D試劑檢測待檢者紅細胞上是否有D抗原。由于Rh(D)陰性獻血者通常受免疫刺激產生ABO以外抗體的幾率比Rh(D)陽性獻血者高[2-3]，因此通常在進行獻血者Rh(D)陰性確認試驗的同時，也對其進行抗體篩選試驗，以避免含有ABO以外抗體的血液產品發放到臨床使用。

在加樣程序設計中，待檢者紅細胞均為儀器吸取全血標本管中壓積紅細胞自動稀釋為濃度0.8%、加樣50 ul，篩選細胞為已配置好0.8%濃度、加樣50 ul，待檢者血漿和抗-D試劑加樣量均為25 ul。編輯Rh(D)陰性確認(Rh Neg)和Rh(D)陰性確認+抗體篩選(Rh Neg+Anti Scr)這兩個試驗程序，以滿足不同試驗要求所需。具體流程為：

1.3.1 Rh Neg每個待檢者檢測需要5孔微柱凝膠孔，加樣時分別在五孔中均先加好各自對應待檢者紅細胞，在每個待檢者的第1孔中加入D1→第2孔中加入D2→……→第5孔中加入D5，加樣結束即進入孵育、離心、結果判讀。

1.3.2 Rh Neg+Anti Scr 試驗每個待檢者需要8孔，每個標本檢測需要一張完整WADiana微柱凝膠抗人球卡。加樣依次為每張卡前三孔依次加入抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細胞→每個待檢者血漿分別加入對應卡的這三孔→待檢者紅細胞加入對應卡的后五孔→每張卡后面五孔依次加上D1、D2、D3、D4、D5，加樣結束即進入孵育、離心、結果判讀。

以上兩個試驗，針對Rh(D)結果判讀規則均設置為D1、D2、D3、D4、D5全陰性，該獻血者定為Rh(D)陰性，若其中任一試劑或一個以上試劑為陽性結果，該獻血者則定為Rh(D)陽性。在Rh Neg+Anti Scr中，若抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔出現1個或者1個以上陽性，表示該獻血者抗體篩選試驗陽性，應進一步復查，以確定其陽性結果由獻血者標本抗凝效果所致或是獻血者血漿中含有ABO以外抗體。

試驗方法編輯完成后，用獻血者標本進行模擬加樣測試，將所有試劑、抗人球卡及標本放置好后，開始運行試驗程序，密切觀察儀器運行，加樣完全按照設計流程進行，加樣后按照規定時間和程序孵育、離心、結果判讀，證明方法編輯正確。

2 結果

取20份已知Rh(D)血型鑒定和抗體篩選結果的標本進行檢測，其結果與試管法檢測結果均一致。

3 討論

Rh血型系統是目前被國際輸血協會確認的29個血型系統中最具復雜性和多態性的血型系統，也是臨床上僅次于ABO系統的重要血型系統。現已發現48個抗原，其中D抗原性最強，與臨床輸血關系最密切[4]。正常的D抗原是由10個外顯子決定的至少9個抗原表位組成的嵌合體，如果缺乏或被其他基因錯代了其中一種以上的因子時，稱為D變異型。D變異型用普通的IgM型抗-D直接鑒定常常為陰性，但是采用不同的IgM+IgG型或IgG型抗-D進行抗球蛋白試驗鑒定，則可能出現1種或1種以上的試劑結果為陽性。D變異型患者若接收了Rh(D)陽性血，可能產生抗-D抗體，因此應接收Rh(D)陰性血；但是，D變異型作為獻血者，因其血液輸入Rh(D)陰性患者體內，也可能刺激患者產生抗-D抗體，故該血液應作為Rh(D)陽性血發往臨床使用。所以若需輸血的患者Rh(D)抗原檢測僅需要IgM型抗-D進行初步鑒定即可，凝集者為Rh(D)陽性，不凝集者為Rh(D)陰性；而獻血者在IgM型抗-D進行初步鑒定為陰性后，進行進一步確認顯得非常重要，根據《全國臨床檢驗操作規程》要求[5]，需用3~5個不同廠家或不同批號的抗-D試劑，采用抗人球蛋白試驗或酶試驗，受檢紅細胞與各批抗-D試劑均不凝集者，才能定為Rh(D)陰性獻血者。同時，由于Rh(D)陰性個體經由輸血或者懷孕等免疫刺激后，產生抗體的幾率遠遠大于Rh(D)陽性個體，因此在進行Rh(D)陰性確認實驗時往往對獻血者進行抗體篩選試驗，以避免抗體篩選陽性的血液被發往臨床引起交叉配血不合，保證臨床用血的安全有效。

目前采供血機構進行Rh(D)陰性確認、抗體篩選時，普遍采用試管法間接抗球蛋白試驗，該方法為手工操作，每個標本檢測都需要用多只試管，需經手工加樣、孵育、生理鹽水反復洗滌、離心等步驟，最后由實驗操作者肉眼判讀結果，試驗人員的工作強度大，結果判斷主觀性大，且實驗結果無法保存，急需通過尋求自動化操作方法，減少試驗過程的人為誤差，降低工作人員勞動強度，確保實驗過程更易標準化，實驗結果判讀更加客觀。根據目前的技術發展，只有微柱凝膠技術(MGIA)能達到和實現上述要求。MGIA是1990年開始應用于紅細胞血型血清學臨床檢驗的，經典抗人球蛋白試驗基礎上發展起來的新型檢測方法，在國外已成為常用紅細胞血型血清學檢測技術，其具有操作簡便、準確、靈敏度高、特異性強、標本用量少、結果可長期保存等優點[6]。目前國內外廣泛應用于血型鑒定、不規則抗體篩查、交叉配血及直接、間接抗人球蛋白試驗中。

WADiana全自動血型/配血儀是由西班牙Grifols公司開發的，基于微柱凝膠技術，利用計算機自動控制操作進行血型血清學試驗的自動化儀器。該儀器通常的檢測程序有ABO正反定型、Rh(D)定型(IgM型試劑)、Rh表現型鑒定(C、c、E、e抗原)、抗體篩選和抗體鑒定、交叉配血，新生兒溶血病檢測等，可以滿足大部分的血型血清學檢測需要，但并無采供血機構進行Rh(D)陰性確認試驗的程序和方法。本文介紹了WADiana在獻血者Rh(D)陰性稀有血型確認試驗中應用的方法。采用此方法，可以同時進行Rh(D)陰性稀有血型確認試驗及抗體篩選試驗，提高實驗的自動化程度，確保實驗過程更易標準化，實驗結果判讀更加客觀，并且可以通過微柱凝膠卡圖像拍攝達到實驗結果的保存信息化。該方法所得結果是否與手工試管法檢測結果完全一致，能否完全替代手工試管法，還需進行大批量標本的實驗檢測，進行進一步的探討。

[1] Langston M M，Proter J L，Cipolin K M，et al.Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing[J].Transfusion，1999，39(3):300-305.

[2] 周國平.上海市Rh陰性獻血者D變異型與不規則抗體調查[J].臨床檢驗雜志，2009，27(3):233-234.

[3] 馬宏偉，謝輝.鄭州市Rh陰性獻血者血清學表型和不規則抗體調查[J].實用醫技雜志，2007，14(3)：276-277.

[4] 朱自嚴.人類血型[M].北京：科學出版社，2007:232.

[5] 中華人民共和國衛生部醫政司.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京:東南大學出版社，2006:249-251.

[6] 渾守永，劉明霞，王玉芝.微柱凝膠技術在紅細胞不規則抗體篩選中的應用[J].現代檢驗醫學雜志，2006，21(1)：37-38.

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.040

成都市衛生局2011年青年基金科研課題(編號：201135)

①成都市血液中心 四川 成都 610041

李健

2012-04-23) (本文編輯：李靜)