大孔樹脂分離純化青錢柳總黃酮的工藝研究

酈紅巖，陳 建，趙 雷

江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司，鎮(zhèn)江 212009

青錢柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljin.]廣泛分布于江西、浙江、江蘇、安徽、福建等地，是我國特有的速生樹種。動物實驗和臨床研究表明，青錢柳有降血壓、降血糖、降血脂、增強免疫力的功效，是一種值得開發(fā)的天然資源[1]。青錢柳中具有豐富的黃酮類化合物，如槲皮素、山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖、山奈酚-4′-甲醚-7-O-β-D-甘露糖[2]、兒茶素、南酸棗喬松素-7-O-吡喃葡萄糖苷[3]等。研究表明，青錢柳黃酮是α-葡萄糖苷酶抑制劑，有很強的抑制活性，能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖[4]。

目前有大量的文獻報道證實，大孔樹脂對于黃酮類物質的純化精制具有良好的效果，已被成功用于多種中草藥中黃酮類物質的分離純化[5]。本研究采用水提、大孔樹脂吸附、解吸來純化青錢柳中總黃酮，為青錢柳的深度開發(fā)提供參考。

1 儀器、原料與試藥

島津UV-2550紫外分光光度儀；CP225D電子天平（德國賽多利斯）。

蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；HPD722、HPD100、D101、HPD400、HPD600、HPD427大孔樹脂 （購自滄州寶恩吸附樹脂材料科技有限公司）。試劑為分析醇；水為蒸餾水。

青錢柳購自福建龍巖地區(qū)，經江蘇大學歐陽臻教授鑒定確認為青錢柳（樣品標本存放于本公司）。

2 總黃酮測定

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.2 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加95%乙醇70 mL，超聲使溶解，加乙醇至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水蘆丁0.2 g）。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取洗脫液25 mL，置50 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，過濾，在500 nm波長處測定吸光度。

2.2 標準曲線制備

精密量取蘆丁對照品溶液 （0.2 mg·mL-1）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應的溶液為空白。照紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度。以濃度C為橫坐標，吸光度B為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程Y=0.0130X-0.01791（r=0.9996）。蘆丁在8.224～49.344 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.3 上樣液的制備

取青錢柳約120 g，粉碎，分別用15、10、10倍量的水提取3次，每次1.5 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮至適當濃度，加乙醇使含醇量為50%，靜置12 h以上，過濾，濾液減壓濃縮，備用。

2.4 大孔樹脂預處理

以95%乙醇浸泡過夜，用純化水洗至無醇味，再用4%的HCl溶液沖洗，水洗至中性；再用4%的NaOH溶液沖洗，水洗至中性。

2.5 大孔樹脂篩選

將已處理好的6種大孔樹脂各15 g濕法裝柱，加入上樣液（相當于10 g藥材量），用水洗至流出液近無色，再用固定量的60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的含量。

表1結果表明，D101大孔樹脂對于青錢柳總黃酮的吸附純化效果較好，因此選用D101大孔樹脂分離純化青錢柳總黃酮。

表1 6種樹脂篩選比較吸附效果

2.6 大孔樹脂的飽和吸附

取處理好的樹脂200mL備用，取青錢柳上樣藥液以10、20、30、40、50、60、70、80 g（按藥材量計）上樣，每次上完樣后用水續(xù)洗至無色，再用60%乙醇400 mL洗脫，測定乙醇洗脫液的吸光度。試驗結果表明，上樣量大于60 g時，乙醇洗脫液的吸光度基本不再變化，故以60 g作為飽和吸附量。

2.7 乙醇洗脫正交試驗及結果

青錢柳提取液用D101大孔樹脂吸附后，用純化水沖洗至流出液近無色，再用適當濃度的乙醇洗脫，搜集洗脫液，以總黃酮含量為考察指標，以上樣量A（1.5、2.0、2.5）、上樣流速B（10、20、30 BV·min-1，BV為倍樹脂體積，下同）、醇洗濃度C（50%、60%、70%）三個因素作為考察因素，選用L9（34）正交表進行試驗。

從試驗結果可知，以總提取物為指標，最佳的提取工藝為A1B3C3，即用1.5 BV的上樣量，30 BV· min-1的上樣流速，70%乙醇洗脫效果最佳；而以總黃酮為指標，最佳的提取工藝為A1B3C1，即用1.5 BV的上樣量，30 BV·min-1的上樣流速，50%乙醇洗脫效果最佳。由于青錢柳中黃酮為有效活性成分，所以選用總黃酮作為主要考察指標，分析結果表明，A（上樣量）對結果影響較大，B（上樣流速）和C（醇洗濃度）相對較小，且綜合上樣的效率來看理想的組合為A1B3C1，確定1.5BV的上樣量，30 BV·min-1的上樣流速，50%乙醇洗脫作為最佳工藝。

2.8 正交試驗驗證

按正交試驗選取的最佳分離純化工藝條件A1B3C1進行重復試驗，3次青錢柳總黃酮的平均含量為75.1%（見表2），表明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 驗證A1B3C1工藝

3 討 論

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且有大孔結構的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網狀結構和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物，是一種不溶于酸、堿及各種有機溶劑的有機高分子聚合物，其孔徑與比表面積都比較大，在樹脂內部具有三維空間立體孔結構，具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構成閉路循環(huán)、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點。目前已廣泛用于中草藥中各種成分的分離純化。本實驗通過比較，發(fā)現(xiàn)D101型大孔樹脂對青錢柳黃酮有較大的吸附量，且容易吸附和解吸，用于分離純化青錢柳總黃酮效果較好。與傳統(tǒng)的分離方法相比較，應用大孔樹脂分離純化青錢柳總黃酮，方法簡便、迅速、經濟。

[1] 謝明勇，李 磊.青錢柳化學成分和生物活性研究概況[J].中草藥，2001，32（4）：365-6.

[2] 李 俊，陸園園，許子競，等.青錢柳中黃酮成分的研究[J].中藥材，2005，28（12）:1058-9.

[3] 張曉瑢，廖 循，丁立生.青錢柳的化學成分[J].應用與環(huán)境生物學報，2001，7（1）：90-1.

[4] 楊武英，上官新晨，徐明生，等.青錢柳黃酮對α-葡萄糖苷酶活性及小鼠血糖的影響[J].營養(yǎng)學報，2007，29（5）：507-9.

[5] 張全香，苑曉威，趙興華.大孔吸附樹脂純化骨碎補總黃酮的研究[J].中草藥，2011，42（4）：708-9.