復方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜研究*

李轉花，胡思玉，余啟波，張德奎

四川科倫藥物研究有限公司，成都 610500

復方魚腥草合劑由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花5味藥經加工制成的復方制劑[1]。具有清熱解毒之功效，用于外感風熱引起的咽喉疼痛，急性咽炎、扁桃腺炎等。為了控制復方魚腥草合劑的質量，有必要研究復方魚腥草合劑的質量檢測方法。近年來有不少文獻報道采用高效液相色譜法測定復方魚腥草合劑中的黃芩苷、綠原酸的含量，但未見相關的指紋圖譜研究報道。本文探索了以HPLC指紋圖譜技術為手段的質量控制方法[2]，以期更有效控制該產品的一致性、重現性。

1 儀器與試藥

色譜儀：Waters2695-2996高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Empower色譜工作站）。

黃芩苷 （110715-200815）、綠原酸 （110753-200413）、槲皮苷（111538-200302）購自中國藥品生物制品檢定所；復方魚腥草合劑由浙江國境藥業有限公司提供；甲醇為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑為分析純；水為超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（150mm×4.6mm，5μm）；以0.1%磷酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B；檢測波長為320 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；分析時間：66 min。理論板數按黃芩苷峰計算應不低于4500。按表1條件進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芩苷對照品、綠原酸對照品、槲皮苷對照品適量，分別加甲醇制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復方魚腥草合劑適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 藥材溶液 取復方魚腥草合劑處方中的各藥材，按照處方比例和提取工藝制備成魚腥草供試品溶液、金銀花供試品溶液、黃芩供試品溶液、連翹供試品溶液、板藍根供試品溶液，分別取適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為藥材溶液供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 指紋圖譜的方法學驗證條件的優化 由于中藥復方的成分復雜，優化的目的是盡量將不同極性的成分簡化在一張色譜圖中得到較好的分離.試驗了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸不同梯度下的色譜圖，比較了Inertsil ODS-3 150 mm×4.6 mm，5 μm和Alltech C18150 mm×4.6 mm，5 μm及Waters C18150 mm×4.6 mm，5 μm等不同牌號的色譜柱的分離效果，并對檢測波長和柱溫等參數進行了優化，最終確定了“2.1”所述色譜條件。

2.3.2 穩定性試驗 取復方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，于0、2、4、6、8、12、24 h進樣進行分析，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.3.3 精密度試驗 精密量取復方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，連續進樣5次檢測，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密量取復方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，取供試品溶液6份，分別進樣測定，觀察各指紋圖譜無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明重復性良好。

2.3.5 指紋圖譜建立 精密吸取對照品溶液、藥材溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件，進行檢測。同一實驗條件下，測定12批供試品HPLC色譜圖。根據不同批次供試品測定結果所給出的峰數、峰值（積分值）和峰位（相對保留時間）等相關參數進行分析、比較，制定優化的指紋圖譜，見圖1～4。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 共有指紋峰的標定 分別取各批次復方魚腥草合劑，按“2.2.2”項方法處理獲得供試品溶液，進樣10 μL，記錄HPLC色譜圖，結果見圖4。主要有9個峰：2號峰為綠原酸；7號峰為黃芩苷；1號峰、6號峰來自于金銀花；3、8號峰來自于黃芩；4號峰來自于連翹；5號峰為黃芩和連翹共有；9號峰來自于魚腥草。因黃芩苷的吸收最強，故以黃芩苷作為參照峰。

經與參照品對照及比較所有測定和記錄的色譜圖，各批次復方魚腥草合劑標定9個共有峰作為指紋圖譜的特征峰（見表2及色譜圖3～4），其中黃芩苷峰為參照峰。

圖1 對照品圖譜

圖2 藥材圖譜

圖3 對照指紋圖譜

圖4 12批樣品指紋圖譜

2.4.2 各批次復方魚腥草合劑指紋圖譜相似度評價 將各批次樣品測定數據導入中國藥典委員會推薦使用的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2004A”，經選峰，設定匹配模板，將峰自動匹配，然后設定標準模板，進行譜峰差異性評價和整體相似性評價。通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件得出復方魚腥草合劑HPLC對照指紋圖譜，與對照指紋圖譜比較，相似度結果見表3。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇，DAD圖譜可見，本品在200 nm～400 nm之間，9個共有峰均有吸收，最終選擇共有峰吸收最強的320 nm作為測定波長。

3.2 本品中魚腥草雖為君藥，其抗菌活性成分癸酰乙醛含量測定已有文獻報道[3]，但采用的是分光光度法，利用HPLC法測定鮮見報道。黃芩苷是復方魚腥草合劑的主要藥理活性成分，黃芩中有效成分黃芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗變態反應，且在本色譜系統中吸收最強。故采用黃芩苷作為參照品。

表2 各批次復方魚腥草合劑指紋圖譜共有峰相對保留時間

表3 復方魚腥草合劑指紋圖譜相似度數據

3.3 在本法條件下復方魚腥草合劑中9個共有峰分離良好，相似度分析結果表明，各批次復方魚腥草合劑之間具有較好的相似性，相似度均大于0.98。本文建立的復方魚腥草合劑指紋圖譜具有重復性好、特征性強、方法簡便等特點，為復方魚腥草合劑的質量控制奠定了基礎。

3.4 復方魚腥草合劑處方中的魚腥草、金銀花、連翹中均含有揮發性成分，本文主要考察了非揮發性成分的指紋圖譜檢測方法，還需對揮發性成分進行氣相色譜研究，建立檢測揮發性成分的指紋圖譜，為更全面地控制復方魚腥草合劑的質量提供依據。3.5 表3相似度計算結果均大于0.98，說明復方魚腥草合劑的工藝穩定，不同批次產品的一致性較好。

[1] 國家食品藥品監督管理局藥品標準[S].WS-10821（ZD-0821）-2002-2011Z.

[2] 李曉蒙，徐位良，何新榮.魚腥草藥材中黃酮苷類成分的HPLC指紋圖譜研究[J].廣東藥學院學報，2005，21（2）：140.

[3] 張 輝，田 英.魚腥草中癸酰乙醛含量的測定[J].光譜實驗室，2003，20（4）：583-5.