針對Abl-T315I突變的Bcr-Abl蛋白激酶抑制劑的研究進展

李婉貞，薛曉文

中國藥科大學 藥物化學教研室，南京 210009

隨著2001年美國FDA批準的第一個治療慢性粒細胞白血病 （chronic myelocytic leukemia，CML）的 Bcr-Abl（Abelson proto-oncogene/breakpoint cluster region）酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的出現(xiàn)，尋找小分子化合物抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶以治療CML逐漸成為人們關注的熱點。然而，隨著臨床應用的增加，部分患者對伊馬替尼產生了耐藥性。伊馬替尼耐藥性的產生主要與Bcr-Abl激酶的突變有關，目前已證實的Bcr-Abl突變有15種，包括Y253H、E255V、E255K、F359V、T315I等在內，其中以T315I在突變中占的比重最大，達20%的耐藥程度，且耐藥程度最高。T315I突變直接影響與伊馬替尼的結合，而不顯著影響與ATP的結合。該突變主要是由較大的疏水性的異亮氨酸 （Ile）替代了Abl激酶315位的蘇氨酸（Thr）造成的，它消除了抑制劑與激酶高親和力的結合所需要的氫鍵，并且在空間上阻礙伊馬替尼與ATP結合位點的結合[1]。為克服伊馬替尼的耐藥問題，新的、更為強效的第二代TKI達沙替尼（Dasatinib）和尼羅替尼（Nilotinib）應運而生，這兩種藥物能克服大部分突變產生的耐藥性，但仍不能有效抑制T315I突變。隨后開發(fā)的一系列藥物如伯舒替尼（Bosutinib）、巴菲替尼（Bafetinib）、塞卡替尼（Saracatinib）等也都對該突變束手無策[2]。更糟糕的是，如果患者反復使用達沙替尼和尼羅替尼等第二代TKI，T315I突變所占的比例會進一步增加。因此，開發(fā)針對T315I突變有效的TKI已迫在眉睫。本文擬就目前正在開發(fā)中的對T315I突變具有抑制活性的Bcr-Abl蛋白激酶抑制劑進行綜述。

1 ATP競爭性抑制劑

1.1 VX-680（MK-0457）（1）

VX-680（MK-0457）是由默克公司（Merck）和維泰士公司（Vertex）共同研發(fā)的一種小分子極光激酶、JAK-2以及FLT3（fms-related tyrosine kinase 3）的多重抑制劑，能夠阻斷細胞周期而引起不同類型的腫瘤細胞的凋亡。令人欣喜的是，VX-680與Bcr-Abl活性部位連接后不僅能抑制野生型Bcr-Abl的活性，還具有抗T315I突變的活性[3]。這種抑制劑是目前報道的第一種對T315I突變有臨床活性的激酶抑制劑，已經進入伊馬替尼耐藥性的CML和ph+ALL（費城染色體陽性的急性淋巴細胞白血病）的2期臨床研究中。

VX-680對Abl-T315突變體的半數抑制濃度（IC50）為30 nmol·L-1。對其晶體結構進行研究，結果顯示，VX-680與極光激酶A（Aurora-A）的鉸鏈區(qū)結合后形成一個疏水口袋，這個疏水口袋能夠與Bcr-Abl和伊馬替尼耐受的突變株結合。這個模型也許能夠解釋VX-680能夠同時抑制Aurora-A、Abl和Abl-T315I突變的原因[4]。

1期和2期臨床研究表明，VX-680給藥后，3例有伊馬替尼耐藥性和T315I突變的病人出現(xiàn)了血液學反應，并且沒有顯著的髓外毒性，其中兩例病人的突變體克隆的濃度也下降了。當VX-680與達沙替尼聯(lián)合用藥時，能夠降低T315I突變以及其他突變發(fā)生的概率，并且提高達沙替尼的治療效果和持續(xù)時間[4]。

令人遺憾的是，在2期臨床研究中，一位患者的心電圖在給藥后發(fā)生改變，這導致Vertex公司終止了該化合物的研發(fā)，但它新穎的分子結構設計策略卻為針對T315I抑制劑的開發(fā)提供了有益的啟示。

1.2 Ponatinib（2，AP24534）

Ponatinib是Ariad公司研發(fā)的口服多種激酶抑制劑，能夠抑制Bcr-Abl、Flt3和Src激酶的活性。它對大多數Bcr-Abl突變株有抑制作用，包括T315I突變株，目前已進入2期臨床研究階段。其對野生型 Abl激酶和 Abl-T315I突變株的 IC50分別為0.37、2.0 nmol·L-1[5]。

與第二代Bcr-Abl激酶抑制劑不同的是，在體外誘變篩選實驗中，Ponatinib沒有引起新的突變。1期試驗結果表明，在2年試驗期中，Ponatinib的MCR率（主要細胞遺傳學緩解率）都持久穩(wěn)定。92%的有T315I突變的患者取得了顯著細胞遺傳學緩解率（MCyR），即費城染色體降至35%或更少。對于沒有T315I突變的患者，MCyR率在一年期達到了61%。對于在先前接受了至少2種以上TKIs治療后均以失敗告終的Ph+CML患者，在服用Ponatinib 后有50%獲得完全的血液學反應。重要的是，隨著時間的推移，Ponatinib能夠持久地緩解病情，并且提高緩解程度。對于有T315I突變的患者來說，這種藥是一種突破。

1.3 達努塞替（3，Danusertib，PHA-739358）

達努塞替是由Nerviano Medical Sciences公司研發(fā)的1，4，5，6-四氫吡咯 [3，4-c]吡唑類似物，是Aurora激酶A和B的ATP-競爭性抑制劑[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)它能夠抑制Bcr-Abl激酶的活性，并且對T315I突變株也有效。

達努塞替在廣泛的人Bcr-Abl陽性與陰性細胞中表現(xiàn)出很強的抗增殖與促凋亡的作用 （IC50=25 nmol·L-1），并且能抑制鼠Ba/F3細胞中異位表達野生型或伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl突變，包括T315I（IC50為0.12 μmol·L-1）。它能夠抑制產生Ph染色體的K562白血病細胞的活性，并且能夠抑制位于Abl激酶的活性環(huán)區(qū)域的Tyr412的磷酸化作用。在白血病細胞株，包括對伊馬替尼耐藥的細胞株中發(fā)現(xiàn)伊馬替尼與達努塞替具有藥理學的協(xié)同作用[5]。目前，該藥正在進行對伊馬替尼耐受和具有Abl-T315I突變的CML患者的2期臨床研究[18]。

1.4 BO1（4）

該化合物是在研究1,3,4-噻二唑類誘導藥時，通過對數據庫內藥效團的分子對接及分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)的。研究表明BO1在抑制Abl激酶活性表現(xiàn)出高度的潛力。在對于伊馬替尼敏感的和耐受的白血病細胞中都顯示出一定的生物活性 （LD50=2.2 μmol·L-1）[8]。它對Abl的抑制能力是Src的5倍。

體外實驗表明，化合物BO1對T315I突變株表現(xiàn)出明顯的抑制作用，它對T315I突變株的抑制能力是野生型Abl的4倍。

該類化合物以游離酶為靶標，在與游離酶形成酶-抑制劑復合物之后，ATP和肽都不能再與相應的酶相結合。對于Abl激酶的情況，其取代位置更為復雜，BO1同時以游離酶以及酶-肽復合物為靶點，阻止ATP的結合[9]。對于野生型Abl，它是個ATP競爭性抑制劑，但當作用于T315I突變株時，表現(xiàn)為非競爭性抑制劑。

2 非ATP競爭性抑制劑

2.1 ON-012380（5）

ON-012380是由Onconova Therapeutics研發(fā)的非ATP競爭型抑制劑，與伊馬替尼不同，ON-012380阻斷底物結合位點，而不是ATP結合位點。體外實驗表明，ON-012380既能抑制野生型ABL激酶，也能抑制所有伊馬替尼耐藥突變的激酶。不僅如此，ON-012380還能抑制血小板衍生生長因子受體（PDGFR）激酶和Src家族的Lyn，但對干細胞因子受體（c-kit）的抑制作用很弱。目前該藥還未進入臨床試驗階段。

ON-012380能夠特異性抑制Bcr-Abl，并且體外實驗表明，在濃度小于10 nmol·L-1時即可引導表達T315I突變體的Ph+CML細胞的凋亡。它能夠顯著地抑制Bcr-Abl的自磷酸化和作為底物的調節(jié)蛋白Crk的磷酸化 （IC50=9 nmol·L-1），是伊馬替尼的10倍以上（IC50=100 nmol·L-1），并且不管是在體內還是體外該化合物抑制T315I突變的活性是伊馬替尼的10000倍，對T315I重組蛋白的IC50為1.38 nmol·L-1（伊瑪替尼幾乎無活性）[10]。當它與伊馬替尼同時給藥時，對抑制Bcr-Abl能夠發(fā)生協(xié)同作用，說明兩者與Bcr-Abl在不同的部位結合，這也進一步證實了ON-012380是個非ATP競爭型抑制劑。

體內實驗表明，對裸鼠腹腔注射100 mg·kg-1，能夠顯著地抑制T315I白細胞的增長。嚙齒類動物對ON-012380的耐受性良好，連續(xù)三周以上每天服用濃度超過100 mg·kg-1也沒有引起血液中毒[10]。

2.2 GNF-2（6）

GNF-2是在尋找能夠靶向性結合Abl激酶中除與ATP結合位點以外的其他部位，從而達到抑制Abl激酶活性的過程中發(fā)現(xiàn)的。它可以不直接抑制Abl激酶區(qū)域，卻能高效選擇性地抑制Abl和Bcr-Abl（IC50=0.14 μmol·L-1）轉變細胞[11]，是非ATP競爭性抑制劑。最新研究表明，在Abl激酶域的C端存在一個肉豆蔻結合口袋，GNF-2通過與其結合使得非活性構象的Abl結構被夾住而處于穩(wěn)定狀態(tài)[12]。

在小鼠模型中，當GNF-2/GNF-5與ATP競爭性抑制劑同時作用于Bcr-Abl時，能夠顯著地減少突變發(fā)生的幾率，并且能夠同時抑制野生型和T315I突變的Bcr-Abl激酶活性[13]。

2.3 DCC-2036（7）

DCC-2036是由Deciphera Pharmaceuticals研發(fā)的，有望治療那些對標準治療發(fā)生抵抗且很少有其他治療選擇的白血病患者。研究發(fā)現(xiàn)，藥物DCC-2036在小鼠模型中可抗擊CML，且對人類白血病細胞有效。這些結果表明，DCC-2036是一種用于臨床研發(fā)治療CML的良好候選藥。目前，DCC-2036正在那些應用兩種其他TKIs無效的患者中進行1期臨床試驗[5]。

DCC-2036能有效抑制磷酸化和非磷酸化狀態(tài)下的Abl活性（IC50=0.8 nmol·L-1），通過非ATP競爭機制，避免與Ile315位阻沖突，同時還能誘導Ba/F3細胞的凋亡。該細胞能表達多種與Bcr-AblTKI耐藥相關的突變株，包括T315I，許多突變的P-環(huán)，達沙替尼耐藥的突變F317L等。DCC-2036對Abl、FLT3、TIE2基因和Src家族激酶具有高度選擇性，對Abl-T315I的IC50為4 nmol·L-1。在100 mg·kg-1· day-1灌胃給藥時，顯著延長患有由野生型Bcr-Abl和T315I逆轉錄病毒表達誘導慢性粒細胞白血病，如延長骨髓增生性疾病的小鼠的生存時間[6]。

由此可見，Bcr-Abl激酶的非ATP競爭性抑制劑也是個戰(zhàn)略性的研究方向。

3 其 他

另有文獻報道一些TKI，如Doramapimod（8，BIRB-796）[14]，Aurora A抑制劑 AT-9283（9）和SGX-70430[5，14]等也具有抑制T315I突變的活性，但這些化合物與Bcl-Abl激酶的作用機制還未見報道。其中SGX-70430的結構還未見文獻報道。

Doramapimod（8）是德國勃林格殷格翰公司研發(fā)的一種新型腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑，主要用于TNF-α水平升高所引發(fā)的一些炎性疾病的治療。最新研究表明，Doramapimod能夠抑制伊馬替尼耐藥的Abl-T315I突變。它與Abl-T315I結合緊密，其親合常數Kd=40 nmol·L-1，但是與野生型Bcl-Abl和其他類型的伊馬替尼耐藥的突變株的結合力要弱得多，Kd＞1 μmol·L-1[15]。

AT-9283（9），是由Astex Therapeutics公司研發(fā)的一種Aurora抑制劑，有文獻報道稱其具有抑制野生型Bcl-Abl和T315I突變的活性，目前該藥物正在進行針對固體瘤以及包括CML在內的血液病的1期臨床研究中，其給藥方式為每星期一次，連續(xù)靜脈注射24小時[16]。

SGX-70430是由美國SGX醫(yī)藥品公司采用FASTTM法開發(fā)出的對野生型Bcl-Abl和4種常見突變（包括T315I）均有效的化合物。體外實驗結果表明，其抑制Ba/F3突變細胞株T315I和M351T細胞增殖的半數有效濃度 （EC50）分別為21 nmol·L-1和15 nmol·L-1，明顯低于伊馬替尼。SGX-70430目前正在進行1期臨床研究。

4 展 望

對伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl突變體生物學結構的認知，使得Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑的研發(fā)進入了一個新的階段。由于T315I突變能引起高水平（＞100倍）的伊馬替尼抵抗，因而針對該突變研究新型有效的抑制劑將具有巨大的藥理學意義。雖然目前還沒有抗T315I突變的激酶抑制劑上市，但已有多個這樣的抑制劑進入臨床研究[2，17-18]。開發(fā)能抑制T315I突變的新穎高效Bcr-Abl抑制劑，并且在聯(lián)合用藥方面作進一步探索，將是治療慢性粒細胞白血病的方向。

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