水飛薊賓口服亞微乳劑的制備及大鼠體內藥動學研究*

高朝陽，李 娟，蘆 霜

中國藥科大學藥劑教研室，南京 210009

水飛薊賓（silybin，SLB）是從菊科植物水飛薊果實中提取得到的一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，臨床上主要用于治療急慢性肝炎及肝硬化。該藥物毒性低，是一種有良好應用前景的肝病治療藥物[1]。但水飛薊賓為水不溶且脂難溶性藥物，難于吸收，在胃腸道易降解，市售普通制劑口服吸收差，生物利用度低[2]。制備安全高效的水飛薊賓口服制劑有很大的研究空間。亞微乳作為藥物載體具有提高藥物溶解度及生物利用度等優勢，近年來受到越來越多的關注[3]。對于油水均不溶性的藥物，亞微乳的載藥量常常難以達到臨床用藥需求，解決亞微乳載藥量低的問題是更好應用該劑型的關鍵。本研究通過薄膜分散法將水飛薊賓分散并包裹于脂質材料中，提高藥物脂溶性，然后將其包裹于亞微乳的油相中，制成水飛薊賓口服亞微乳。研究水飛薊賓口服亞微乳在大鼠體內的藥動學特征，并以市售水林佳膠囊為參比制劑，評價了其口服相對生物利用度，為該產品的開發和應用提供依據。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

水飛薊賓對照品 （中國藥品生物制品檢定所，純度：99.5%）；水飛薊賓原料藥（盤錦格林恩生物資源開發有限公司）；甲萘酚（中國醫藥集團上海化學試劑公司）；水林佳（水飛薊賓磷脂復合物膠囊，天士力公司，35mg/粒）；中鏈脂肪酸甘油脂（MCT，法國嘉法賽公司）；吐溫80（Tween80，遼陽奧克納米材料有限公司）；大豆磷脂（SPC，上海太偉磷脂有限公司，PC含量＞80%）；聚乙二醇400（PEG 400，汕頭市西隴化工廠公司）；油酸（OA，上海國藥集團）；甲醇（色譜純）；乙醚（分析純）。

1.2 儀器與設備

IY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 （南京貝帝實驗儀器有限公司）；Zetasizer3000 HAS激光粒徑測定儀（英國Malvern公司）；NDJ-79型旋轉式粘度計 （同濟大學機電廠）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市精達儀器制造廠）；透析袋（中國醫藥集團上海化學試劑公司，截留分子量8000～10000）；TGL-16離心機（上海安亭科學儀器廠）；島津LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津）。

1.3 實驗動物

SD大鼠 （南京市江寧區青龍山動物繁殖場，SCXK（浙）2008-0033），體重（200±20）g，雄性。

2 方法與結果

2.1 水飛薊賓亞微乳的制備及質量評價

2.1.1 薄膜分散-探頭超聲法制備水飛薊賓亞微乳精密稱取水飛薊賓30 mg、磷脂120 mg、膽固醇20 mg置于茄形瓶中，加混合溶劑（甲醇-乙醚=4∶1，v/v）10 mL超聲溶解，40℃下減壓蒸干除去混合溶劑，形成藥物的脂質薄膜。再加入MCT 1000 mg和油酸 30 mg，50℃加熱混合均勻形成油相；將Tween80 500 mg、PEG400 180 mg溶于10 mL純凈水中，混合均勻形成水相。兩相分別加熱至50℃保溫，將油相緩慢滴加入水相，磁力攪拌10 min后得初乳，探頭超聲儀（200W）超聲振蕩5 min，即得水飛薊賓亞微乳。

2.1.2 亞微乳的粒徑及電位

取水飛薊賓口服亞微乳適量，用純凈水適當稀釋后，采用Zetasizer3000 HAS激光粒徑測定儀測定亞微乳的粒徑與Zeta電位，測定3批。結果表明：水飛薊賓亞微乳的平均粒徑為（155.9±2.2）nm，多分散指數 （PDI）為0.06±0.01，Zeta電位為－（29.62± 0.03）mV。

2.1.3 亞微乳的粘度

以旋轉式粘度計測定水飛薊賓亞微乳劑的粘度，測得水飛薊賓亞微乳劑的粘度為3.00 mPa·s。說明水飛薊賓亞微乳粘度較小，適合口服使用。

2.1.4 含量測定及體外釋放研究

2.1.4.1 HPLC法[4]

色譜條件：色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（49∶51）；檢測波長：288 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣體積：20 μL。

標準曲線的繪制：配制濃度分別為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00 μg·mL-1的水飛薊賓標準液，按上述色譜條件，經HPLC法測定。以水飛薊賓兩異構體的峰面積之和（A）對濃度（C）進行線性回歸，得標準曲線：A=5.17×104C+3861.3，r=0.9995。配制濃度分別為1.00、4.00、10.00 μg·mL-1的水飛薊賓標準液，測定日內及日間精密度（RSD）均小于5%（n=3），回收率為97%～99%（n=3）。

2.1.4.2 含量測定

精密吸取0.5 mL水飛薊賓亞微乳轉移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，超聲20 min破乳，取1 mL轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，取20 μL進樣，測定3批。結果表明：水飛薊賓亞微乳中藥物含量為（2.93±0.07）mg·mL-1。

2.1.4.3 體外釋放研究

精密量取1.0 mL水飛薊賓亞微乳溶液劑轉移至透析袋中，置于200 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液（含0.25%Tween80）中，（37±0.5）℃水浴條件下往復振蕩（100 r·min-1）。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、 10、12 h取樣2 mL（同時補加2 mL釋放介質）。樣品用HPLC法分析測定。以累積釋放率對時間作圖，釋放曲線見圖1。

圖1 水飛薊賓亞微乳體外釋放曲，n=3)

由結果可知，水飛薊賓亞微乳初期釋放較快，后期釋放較為緩慢，這可能與藥物在亞微乳劑中的分布有關。分布于水相中的藥物能夠快速釋放，而分布于油相中的藥物則先要從脂質材料中擴散至油相，再從油相擴散至水相。

分別采用不同釋藥模型對水飛薊賓亞微乳的釋藥曲線進行擬合，擬合結果見表1。結果表明，水飛薊賓亞微乳劑的體外釋放符合Weibull方程。

表1 水飛薊賓亞微乳體外釋放擬合方程

2.2 水飛薊賓口服亞微乳大鼠體內藥動學

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（45∶55）；檢測波長：288 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣體積：20 μL。2.2.2 血漿樣品的處理

精密移取大鼠血漿100 μL，加入內標液（甲萘酚，7.8 μg·mL-1）10 μL，渦旋30 s，混勻后，加入乙醚4 mL，渦旋3 min，3000 r·min-1離心10 min，取上層乙醚4 mL，再加乙醚4 mL重提1次，合并乙醚，于40℃水浴下空氣吹干。加入流動相比例的醇水溶液100 μL復溶，渦旋1 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.2.3 方法專屬性

分別取空白血漿、空白血漿加入水飛薊賓與甲萘酚的樣品和體內實測樣品，按照 “2.2.2”項進行血樣處理，HPLC法進行測定，記錄色譜圖，考察血漿內源性物質對水飛薊賓及內標甲萘酚的檢測是否有干擾。結果見圖2。由圖2可知，血漿內源性物質對水飛薊賓及甲萘酚的檢測無干擾，分離情況良好，表明該方法具有較高的專屬性。

圖2 水飛薊賓的色譜圖（A）空白血漿；（B）空白血漿加入水飛薊賓與甲萘酚；（C）大鼠灌服水飛薊賓亞微乳體內實測樣品的色譜圖；1-水飛薊賓；2-甲萘酚

2.2.4 標準曲線的建立及方法學的驗證

取空白大鼠血漿100 μL，分別加入水飛薊賓標準溶液，配制成濃度為0.05、0.25、0.50、1.00、1.50、3.00、5.00 μg·mL-1的血漿樣品，加入內標液10 μL，按照“2.2.2”血漿樣品處理方法操作后，經HPLC法測定。以水飛薊賓與甲萘酚峰面積的比值（As/Ai）對水飛薊賓在血漿中的濃度（C）進行一元線性回歸，繪制標準曲線。取空白大鼠血漿加入水飛薊賓標準溶液，配制成低（0.05 μg·mL-1）、中（1.00 μg·mL-1）、高（5.00 μg·mL-1）三個質量濃度的血漿樣品，分別加入內標液10 μL，按“2.2.2”血漿樣品處理方法操作，考察方法學的回收率、精密度及血漿樣品的穩定性。

實驗得到的標準曲線方程為As/Ai=0.7948C+ 0.0098，r＝0.9998，線性范圍為0.05～5.00 μg·mL-1。測定日內及日間精密度（RSD）均小于5%(n=3)，方法回收率為96%～98%（n=3），說明該方法符合生物樣品的分析測定要求。水飛薊賓血漿樣品在-20℃條件下貯存5天及經過前處理后-20℃放置1天后樣品濃度RSD均小于5%（n=3），說明血漿樣品在分析所需要的時間周期內能夠保持穩定。

2.2.5 血漿樣品采集和處理

健康的雄性SD大鼠12只，隨機分成對照組和實驗組，每組6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。將受試制劑（自制水飛薊賓亞微乳劑）與參比制劑（市售水飛薊賓磷脂復合物水林佳膠囊）分別灌胃給藥，劑量均為50 mg·kg-1，給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h于大鼠眼底靜脈叢取血 200 μL，5000 r·min-1離心10 min，取上層血漿，置-20℃冷凍保存備用。將血漿樣品按“2.2.2”處理后，HPLC法測定血藥濃度。

2.2.6 藥動學軟件處理

12只大鼠服用水飛薊賓亞微乳劑及水林佳膠囊后的體內血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖3 大鼠灌服水飛薊賓亞微乳和水林佳膠囊的血藥濃度-時間曲線（，n=6）

用統計矩法對兩種制劑的藥動學數據進行處理，并對兩種制劑的藥動學參數進行t檢驗，結果如表2所示。水飛薊賓亞微乳在大鼠體內平均滯留時間（MRT）延長為水林佳的2倍，清除速率（CL）為其1/3，表明亞微乳顯著延長了藥物在體內的滯留時間。水飛薊賓亞微乳與水林佳膠囊的AUC0-∞分別為（1.83±0.38）mg·h·L-1和（4.72±0.48）mg·h·L-1，水飛薊賓亞微乳在大鼠體內的生物利用度為水林佳膠囊的2.58倍，表明水飛薊賓亞微乳促進了藥物在胃腸道的吸收，提高了口服生物利用度。

表2 大鼠灌服水林佳膠囊和水飛薊賓亞微乳的藥動學數據（，n=6）

表2 大鼠灌服水林佳膠囊和水飛薊賓亞微乳的藥動學數據（，n=6）

注：*水飛薊賓亞微乳與參比制劑水林佳膠囊比較，P＜0.05

?

3 討 論

水飛薊賓為油水均難溶性藥物，若直接將水飛薊賓加入油相制備亞微乳，所得亞微乳載藥量低，不能達到臨床用藥要求。本文將水飛薊賓通過簡單的薄膜分散法包裹于脂質材料中，提高了藥物的脂溶性，與合成水飛薊賓磷脂復合物相比，不需要繁瑣的合成工藝和大量的有機溶劑，提高了制劑的生產效率和安全性。

水飛薊賓口服亞微乳藥時曲線出現雙峰現象，可能與藥物的釋放情況有關。水飛薊賓在油水兩相中均有一定的分配，口服該制劑后，水相中的藥物先釋放出來被快速吸收出現第一個峰，而位于界面膜及包裹于油相脂質材料中的藥物被吸收后而出現第二個峰。還可能與藥物多部位吸收有關。水飛薊賓亞微乳灌胃給藥后，在胃中迅速吸收出現第一個峰，然后水飛薊賓亞微乳進入腸道吸收出現第二個峰。

水飛薊賓亞微乳顯著提高了藥物的口服生物利用度，其機理主要有以下幾個方面：水飛薊賓在胃腸道中易降解，將其包裹于亞微乳內部，可避免被胃腸道中的酶降解；亞微乳粒徑較小，在進入胃腸道后能夠廣泛分布，與胃腸黏膜充分接觸，有利于藥物的吸收利用；亞微乳中的表面活性劑和助表面活性劑可以減低腸道表面粘液的粘度，增加了細胞膜的通透性，從而增加藥物吸收[5]；亞微乳中的脂質能夠興奮脂蛋白的形成，促進小腸淋巴循環，促進藥物在小腸部位的淋巴轉運，降低首過效應，從而提高了生物利用度[6]。

[1] 陳 紅.水飛薊賓的藥理作用 [J].藥學情報通訊，1991，9（3）：7-9.

[2] Chopra S,Motwani SK,Iqbal Z,et al.Optimisation of polyherbalgelsforvaginaldrug delivery by Box-Behnken statistical design [J].J Pharmacokinet Biopharm,2007,67(1):120-31.

[3] Sznitowska M,Janicki S,Dabrowska E,et al.Submicron emulsions as drug carriers studies on destabilization potential of various drugs[J].Eur J Pharm Biopharm,2001,12(3):175-9.

[4] 張 勇，李 娟.PEG修飾水飛薊素脂質體的制備及體外釋放研究[J].藥學與臨床研究，2010，18（3）：239-46.

[5] Chen Y,Li G,Wu XG,et al.Self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS)of vinpocetine:formulation development and in vivo assessment[J].Biol Pharm Bull,2008,31(1):118-25.

[6] Sha XY,Yan GJ,Wu YJ,et al.Effect of selfmicroemulsifying drug delivery systems containing Labrasol on tight junctions in Caco-2 cells[J].Eur J Pharm Biopharm,2005,24(5):477-86.