MicroRNAs與多潛能干細胞的研究進展

王彩云, 楊世華

(昆明理工大學 生命科學與技術學院, 云南 昆明 650500)

MicroRNAs與多潛能干細胞的研究進展

王彩云, 楊世華*

(昆明理工大學 生命科學與技術學院, 云南 昆明 650500)

microRNAs (miRNAs)是一類內源性非編碼小 RNA, 通過調控基因表達來參與生命過程中的一系列重要進程。越來越多的證據表明, miRNAs參與了幾乎所有生物代謝過程, 其胚胎干細胞的自我更新與分化和在多能干細胞(iPSCs)中的誘導調節作用也日益受到關注。該文介紹了miRNAs的生成、檢測方法以及miRNAs對胚胎干細胞(ESCs)及誘導多能性干細胞的調控作用, 并對miRNAs的應用前景進行了展望。

miRNAs; miRNAs檢測; 胚胎干細胞; 誘導多能性干細胞

微小核糖核酸 (microRNAs, miRNAs)是細胞內一類長度在20～25 nt的非編碼單鏈RNA, 廣泛存在于真菌和動、植物中, 在物種進化過程中高度保守。它的表達既具有時空特異性, 也具有組織和細胞特異性。編碼miRNAs的序列可以位于編碼或是非編碼基因的內含子或者外顯子附近, 也可以位于基因之間(Bartel, 2004; Rodriguez et al, 2004)。絕大部分miRNAs是在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成(Kim, 2005), 其成熟先后在細胞核和細胞質中完成, 其中Dicer 1和DGCR 8是miRNAs成熟過程中兩個重要基因(Ghildiyal & Zamore, 2009)。miRNAs成熟后與Argonautel (AGO1)蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC), 通過與靶 mRNAs的 3′非翻譯區(3′UTR)配對降解mRNA或抑制mRNA的翻譯, 從而在轉錄后水平調控蛋白表達, 行使其多樣的生物學功能(Tolia & Joshua-Tor, 2007)。最新研究表明，miRNAs也能在轉錄水平調控基因表達。

在生物體內, 雖然 miRNAs的作用是特異的,但靶點特異性并不強, 往往一個 miRNA可以靶向多個mRNA，而一個mRNA也可能是多個miRNAs的靶標, 這樣就形成了以miRNAs為主的龐大調控網絡, 從而從整體上調控生物體的生理進程(Tiscornia & Izpisúa Belmonte, 2010; Zhang & Wen,2010; Huang et al, 2008)。

1 miRNAs的檢測方法

miRNAs檢測方法的快速發展為研究其功能提供了良好的平臺。目前miRNAs檢測一般是基于核酸雜交與擴增的原理, 主要有Northern印跡、實時定量PCR、微陣列芯片等3種方法。Northern印跡技術一直被應用于miRNAs的鑒定和miRNAs的發現, 是目前 miRNAs檢測中最常用的方法, 通常被用來作為新技術可靠性的驗證手段; 實時定量PCR主要用于定量檢測 miRNAs, 具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性好、重復性佳等特點, 可以滿足大多數miRNAs在組織和細胞中表達水平的研究; 微陣列芯片(microaaray)是實現 miRNAs表達圖譜分析和多種miRNAs高通量同時檢測的主要技術, 一般用于miRNAs的初篩實驗。另外, 利用高通量測序(High Throughput Sequencing)能在無需任何序列信息的前提下研究microRNA的表達圖譜, 還可發現和鑒定新的microRNA分子(Schulte et al, 2010)。此外, 還有很多不同的檢測手段也常用于 miRNAs的檢測，如Chapin & Doyle (2011)報道了利用滾環擴增(RCA)在編碼的凝膠微粒上對亞飛摩爾(sub-femto molar, 即<10-15M)量級的 miRNA 進行多重定量檢測, 且能達到單分子的分辨率。該方法可以對極少量血清中的miRNAs進行直接檢測而不需要提取RNA。Harcourt & Kool (2012)利用滾環擴增檢測miRNAs時, 首次通過化學方式使Q-STAR探針自動成環, 而不需要使用單獨的連接酶進行環化反應, 這在一定程度上降低了實驗的復雜性和成本。這些新的檢測技術不斷被開發, 為miRNAs的檢測提供了新的思路。

2 miRNAs調控胚胎干細胞的命運

胚胎干細胞(ESCs)具有無限自我更新以及分化成任何特定類型細胞的能力, 表達著一套獨特的、與細胞快速增殖和周期進展相關的 miRNAs。這些miRNAs主要包括miR-302/367家族(miR-302a/b/c/d和miR-367)(小鼠)；miR-290-295家族(miR-290/291a/291b/292/293/294和miR-295)和miR-371-373家族(miR-371/372/373)(人類)。研究ESCs的關鍵問題之一是了解其干性(stemness)維持和分化的機制, 最近研究表明, miRNA在調控胚胎干細胞自我更新和分化方面發揮著重要作用。

2.1 miRNAs控制ESCs增殖

目前認為, miRNAs可以通過作用于細胞周期抑制因子, 來維持胚胎干細胞特殊的細胞周期進程。胚胎干細胞的細胞周期特殊性在于, 其 G1期非常短, 且缺失G1/S關卡。這就使得它可以無限制地由G1期向S期轉變, 進而快速增殖。然而，隨著胚胎干細胞的分化, G1/S關卡也就隨之恢復。參與ESCs細胞周期調控的miRNA被稱之為“胚胎干細胞調控型 miRNA(embryonic stem cell cycle regulating miRNA, ESCC miRNA)”。

研究發現, 一些miRNAs在胚胎干細胞中會優先表達，如miR-290家族在未分化小鼠ESCs中高度表達, 其表達水平隨著 ESCs的分化而迅速下降(Houbaviy et al, 2003), 這些miRNAs可以促進細胞由G1期向S期轉變, 從而加速ESCs增殖 (Wang et al, 2008; Lichner et al, 2011), 具有維持ESCs多能性的作用。在小鼠ESCs中, 由于缺少cyclin D-Cdk4/6復合物, G1期向S期的轉變主要由cyclin E-Cdk2信號通道調控。而miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-294、miR-295和miR-302d可以通過直接靶向cyclin E-Cdk2信號通道的抑制因子p21、p130(Rb12)和Lats2來激活 cyclin E-Cdk2通道(Wang et al,2008)。另外一些研究則表明, 在人類的ESCs中, 如果將miR-17-92家族成員miR-92b下調, 會導致細胞停留在G1期, 而上調miR-92b, 則會促進細胞由G1期向S期轉變。進一步的研究證明,miR-92b是通過靶向G1/S關卡抑制因子p57, 來調節細胞周期進程的(Sengupta et al, 2009)。此外, 相關的文獻也證實miR-372可以靶向 G1/S關卡限制因子Cdkn1a,miR-195能通過靶向G2/M關卡限制因子WEE1, 來調控ESCs的細胞周期進程(Qi et al, 2009)。

另外, miRNAs可以通過與相關基因作用來維持 ESCs的多能性，如 Marson et al (2008)證實miR-290家族的啟動子受到胚胎干細胞內特異的轉錄因子Nanog、Oct4、Sox2的調控, 并且可以穩定Oct4的表達, 通過重新進行 DNA甲基化而調節ESCs的干性維持。同樣, miR-302-367家族的啟動子受ESCs內特異性的轉錄因子Nanog、Otc3/4、Sox2和Rex1的調控(Barroso-delJesus et al, 2008), 不僅能與靶基因cyclin D1和Cdk4作用, 調節ESCs的細胞周期進程 (Card et al, 2008), 而且可以與靶基因NR2F2(Rosa & Brivanlou, 2011)和Lefty(Barroso-DelJesus et al, 2011)作用, 對ESCs的早期分化產生抑制, 從而維持其多能性。

2.2 miRNAs控制ESCs分化

ESCs在定向分化過程中會開啟兩個重要的程序, 包括關閉胚胎干細胞的自我更新程序, 以及激活組織特異性的定向分化程序。最近研究發現, 將let-7導入GDCR8蛋白缺失的未分化的ESCs中, 可以有效抑制ESCs中的自我更新程序。同時，這種抑制也可以被 ESCC miRNA逆轉, 表明let-7和ESCC miRNA之間是可以互動的。這就提供了一個能夠支配細胞命運的機制。在進一步的研究中, 發現let-7能抑制c-Myc、Sall4、Lin28和下游靶基因Sox2、Oct4、Nanog的表達；而將let-7導入野生型ESCs中, 則未能誘導 ESCs的分化, 表明 ESCC miRNA能拮抗Let-7的分化作用(Melton et al, 2010)。

除let-7以外, 還存在其他調控 ESCs分化的miRNAs，如在小鼠 ESCs中,miR-200c、miR-203以及miR-183共同抑制多能性因子Sox2和Klf4。當將這些miRNAs導入ESCs中時, 會降低ESCs的自我更新能力(Wellner et al, 2009)。還有研究表明，miR-145在人類ESCs中會抑制Sox2、Oct4和Klf4的表達, 從而抑制 ESCs的自我更新能力。當導入反義寡核苷酸抑制miR-145表達時, 人類ESCs就會恢復自我更新能力(Xu et al, 2009)。另外,miR-371-3的表達與人類ESCs向神經細胞分化潛能則呈負相關。當將Klf4基因轉導至神經細胞中提高miR-371-3的表達時,Klf4轉導的神經細胞顯示出多能標記物表達的改變, 相反, 若在Klf4轉導的神經細胞中抑制miR-371-3的表達，則可恢復其神經性分化傾向。這些均表明，miR-371-3有可能在人類多能干細胞神經性分化行為過程中發揮關鍵性作用(Kim et al, 2011)。最近, Boissart et al (2012)通過抑制人類 ESCs中 TGFβ信號通道證明了miR-125的兩亞型(miR-125a和miR-125b)參與了人類 ESCs分化為神經細胞系的過程。功能分析表明,miR-125通過靶向抑制核心信號轉導分子SMAD4的表達,從而促進了人類ESCs向神經前體細胞的轉變。

有研究發現, miRNAs還存在另一種控制胚胎干細胞種系分化決定過程的機制, 即某些組織特異性miRNAs能通過抑制或促進胚胎干細胞分化為特定的細胞系, 顯示出miRNAs的網絡調控能力，如在心肌細胞發育過程中特異表達的miR-1和miR-133受到相同上游基因的調控； 但是它們在控制中胚層向心肌細胞分化過程中的作用卻不一致(Ivey et al, 2008)。

3 miRNAs與誘導多能干細胞

誘導多能干細胞(iPSCs)首先是由 Takahashi &Yamanaka在2006年利用轉錄因子Oct4、Sox2、Klf4和Myc實現的, 雖然他們得到的細胞與真正的ESCs相比還存在著許多差異, 但是這一研究開創了利用少數幾個因子來誘導 iPSCs產生的先例(Takahashi & Yamanaka, 2006)。隨后, Yu et al (2007)利用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28誘導體細胞產生了iPSCs, 其中Lin28會抑制少數pri-miRNA的成熟(Viswanathan et al, 2008), 這意味著, 胚胎干細胞特異性miRNAs可能適用于體細胞的重新編程。

近年來, 科學家開始嘗試應用miRNAs與轉錄因子共同誘導體細胞重編程，如 Judson et al (2009)利用逆轉錄病毒載體用不同的 miRNAs和Oct4、Sox2、Klf4一起轉染小鼠胚胎成纖維細胞, 發現重編程效率顯著提高, 其中miR-294對重編程效率影響最大, 使iPSCs產生效率從0.01%～0.05%提高到了0.4%～0.7%。Lin et al (2011)利用誘導性miR-302表達系統研究miR-302表達量對重編程的影響時發現, 當miR-302在人類毛囊細胞(hHFCs)的表達量超過胚胎干細胞H1和H9亞型表達量的1.3倍時就可以誘導其重編程。miR-302的靶基因包括4個遺傳調控因子AOF2、AOF1、MECP1-p66和MECP2,沉默AOF2將導致DNMT1的失活并增強其去甲基化過程, 從而提高hHFCs重編程效率。近期Liao et al (2011)通過把miR-106a-363家族、miR-302-367家族和3個外源性因子(Oct4、Sox2、Klf4)一起轉染小鼠胚胎成纖維細胞可以顯著提高iPSCs的產生效率。其中miR-302-367家族通過靶向TGFβ-receptor 2來促進 E-cadherin的表達, 從而加速間充質向上皮轉化(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。另外,miR-93及其家族成員也可以通過抑制TGFβ-receptor 2加速 MET過程, 進而提高誘導小鼠iPSCs形成的效率(Li et al, 2011)。上述研究結果均表明，ESCs特異性 miRNAs的表達能促進細胞重新編程。

有趣的是, 通過抑制組織特異性miRNAs表達也能促進iPSCs的形成。Rybak et al (2008)將let-7反義引物抑制劑和Sox2、Oct4、Klf4瞬時轉染小鼠胚胎成纖維細胞后, 重編程效率提高了 4.3倍。另外, 近年來發現，p53信號途徑對細胞重編程具有阻礙作用, 抑制或敲除p53可以促進細胞重編程效率(Banito et al, 2009; Kawamura et al, 2009)。Choi et al (2011)證實miR-34家族，尤其是其成員miR-34a以p53依賴性方式參與了對體細胞重編程的調控。不同于p53缺陷在提高重編程效率的同時導致生成的iPSCs喪失了多潛能性,miR-34a基因敲除不僅可以促進小鼠體細胞重編程為iPSCs, 且生成的iPSCs維持了自我更新或分化能力。進一步分析表明,miR-34a有可能是通過負調控Nanog、Sox2和Mycn基因而發揮重編程抑制效應的。此外, 研究人員還證實miR-34家族的另外兩個成員miR-34b和miR-34c也對體細胞重編程有抑制效應。

最近研究證明, miRNAs具有直接誘導體細胞重編程的能力, 且其效率高于利用轉錄因子Sox2、Oct4、Klf4和Myc進行的體細胞重編程, 致瘤性低。Anokye-Danso et al (2011)利用慢病毒載體導入miR-302b/302c/302a/302d/367cluster和丙戊酸, 成功將小鼠胚胎成纖維細胞以及人成纖維細胞重編程為 iPSCs, 這是科學家首次未使用 4個轉錄因子制造出的 iPSCs。與之前誘導重編程方法相比, 這種新方法將重編程效率提高了100倍以上。有趣的是, 重編程鼠類細胞時丙戊酸是必須的, 但單獨用miR-302/367就能有效地重編程人類細胞。組蛋白脫乙酰化酶(Hdac2)的作用可以部分解釋產生這種差異的原因。有研究指出，Hdac2的功能是細胞重編程的一個重要障礙, 而丙戊酸可以破壞 Hdac2。小鼠成纖維細胞中Hdac2的表達水平明顯高于人類的成纖維細胞, 說明丙戊酸通過抑制Hdac2的功能而促進小鼠iPSCs的形成。另外, Miyoshi et al (2011)對小鼠脂肪基質細胞(mASCs)中miRNAs表達圖譜進行分析, 發現相對于mASCs, 小鼠ESCs和iPSCs中mir-200c、mir-302家族及mir-369家族呈高水平表達。將這3個家族miRNAs導入到mASCs中后,發現 mASCs可以重編程為 iPSCs。同時，這些miRNAs介導的iPSCs能夠表達未分化ESCs的特征性基因。當研究人員將相同的miRNAs導入到人類脂肪基質細胞及皮膚纖維細胞中, 這些 miRNAs同樣能夠誘導人類體細胞重編程為iPSCs。此外, 直接轉染成熟的雙鏈miR-200c、miR-302家族及miR-369家族, 這在一定程度上減少了腫瘤發生的可能性和增強了安全性, 在臨床治療上會更加可靠。由此看來, 利用miRNA誘導iPSCs可能是一種理想的方法。

4 展 望

miRNAs的發現, 為我們研究生物體生長發育、分化調控以及iPSCs提供了強有力的工具和全新的研究思路。雖然對miRNAs的研究取得了較大進展(Wang et al, 2012), 但仍然面臨著很多問題。首先,miRNAs的檢測手段存在自身優點的同時也或多或少存在不足。高靈敏度、高通量、高特異性的檢測技術將更好地推動miRNAs的發展。其次, 被證實的和明確功能的miRNAs的數量還很少, 其在各個生命活動中所扮演的角色尚未完全明了。尋找調控的 miRNAs基因以及 miRNAs的靶基因, 揭示miRNAs具體的作用機制尤為重要。再次, 考慮到臨床應用的安全性和效率, 研究非介入型的miRNA載體和（或）直接的轉染技術將成為研究者接下來要解決的重要任務之一。

隨著研究的不斷深入, 人們對miRNAs控制網絡的認識必將越來越全面, 對其功能和作用機制的了解也將會更加透徹。我們可以相信, miRNAs必將為生命科學的研究和生物醫學的發展等方面帶來更為深遠的影響。

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Research on MicroRNAs in pluripotent stem cells

WANG Cai-Yun, YANG Shi-Hua*

(Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming650500,China)

MicroRNAs (miRNAs) are a newly identified class of small regulatory non-coding endogenous RNAs that take part in a series of important processes by regulating gene expression. Recent studies have provided evidence that miRNAs may be involved in nearly all biological and metabolic processes, especially influencing self-renewal and differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this review, we briefly summarize the biological characteristics of miRNAs, the detection technologies, and the role of miRNAs regulation in ESCs and iPSCs to frame a discussion on the future prospects of miRNA research.

miRNAs; miRNAs detection; ESCs; iPSCs

Q522; Q813

A

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10.3724/SP.J.1141.2012.04416

2012-03-19；接受日期：2012-06-21

國家自然科學基金項目(31071279); 云南省科技創新人才計劃項目(2011CI009)?

Corresponding author)，E-mail: yangsh@kmust.edu.cn

王彩云, 女, 碩士, E-mail：seeyun2010@163.com