煙草突變體篩選與鑒定方法篇：4.煙草抗干旱突變體篩選與鑒定

李廷春，楊華應

（安徽省農業科學院煙草研究所，合肥 230031）

煙草經甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理可以分離得到多種突變體，這些突變體的獲得將為揭示煙草生長發育規律奠定基礎。煙草突變體的篩選已成為許多重要理論問題得以解決的前體，而篩選方法是突變體篩選成敗的關鍵。

干旱是影響植物生長發育的主要環境因子之一[1]。煙草在生長過程中，特別是從團棵期進入旺長期常常遭遇干旱，干旱已經成為影響其營養生長的重要因素。利用突變體材料篩選煙草抗旱突變體，不僅可為抗旱基因克隆及功能分析奠定基礎，還對于進一步探索水分脅迫信號轉導及應答干旱脅迫的分子機制具有重要的意義。

1 抗干旱突變體的高通量篩選

對擬南芥突變體的研究表明，每5萬株經EMS誘變的擬南芥M2代，其基因中的每一個基因至少有一次發生突變的機會[2]。對于如此大規模的突變體篩選工作，尤其對煙草這種植株較大的植物，建立一種快速、有效的篩選方法是獲得具備優良性狀突變體的關鍵。

煙草抗干旱篩選根據其處理方式可分為自然干旱和高滲溶液處理模擬干旱，由于自然干旱所需時間周期長，個體差異較難控制，誤差較大，所以采用高滲溶液處理模擬干旱是較為常用的方法。目前，常用于模擬干旱的高滲溶液是PEG6000溶液，PEG6000是一種高分子量的非滲透調節劑，對水分表現出強烈的親和性，由于其對植物無毒害的特點，已被廣泛用于模擬干旱逆境條件，進行抗旱材料篩選與干旱響應機制的研究[3-7]。根據PEG6000溶液處理時期的不同，抗旱篩選主要有：（1）發芽期抗旱試驗，采用PEG6000溶液處理煙草種子，根據發芽率、發芽勢篩選抗旱突變體；（2）煙草種子發芽后，待子葉完全展開時，采用PEG6000溶液處理煙草小苗，根據植株萎蔫狀態、生長量變化篩選抗旱突變體；（3）苗期抗旱試驗，待煙草幼苗長至6～8片葉時，采用PEG6000溶液處理，根據葉片生長狀態、相關生理指標（相對含水量、脯氨酸含量等）篩選抗旱突變體。試驗結果表明，發芽期抗旱試驗受種子活力影響較大，苗期抗旱試驗存在周期長、工作量大等缺點，因此，采用25%PEG6000處理發芽后小苗進行抗旱篩選是篩選煙草抗旱突變體較為理想的方法。具體方法如下：精選大小一致、籽粒飽滿、無破損的種子，采用9 cm濾紙作為載體，種子發芽后，待子葉完全展開時，加入25%PEG6000的水溶液，連續培養5 d后，依據小苗萎蔫、根長生長情況篩選抗旱的煙草突變體材料。

2 煙草抗干旱突變體的鑒定

煙草抗干旱是個復雜的生理過程，與氣孔蒸騰、根系活力、脯氨酸積累等均存在密切的關系，植株的抗旱性可通過田間表型、細胞組織學鑒定、生理生化指標測定以及抗旱相關基因的克隆與表達分析來進行驗證[8-11]。

2.1 田間表型鑒定

結合田間和旱棚，對抗干旱突變體材料進行至少2年以上的表型鑒定，包括農藝性狀測量、干物質積累測定和計產試驗等。

2.2 細胞組織學鑒定

采用顯微技術，對正常、干旱條件下的抗干旱突變體材料葉片組織的氣孔特征進行觀察，并對細胞組織鑒定。

2.3 生理生化鑒定

通過測定干旱條件下，抗干旱突變體材料的抗氧化酶系統、脯氨酸含量、相對含水量、蒸騰速率、根系活力等生理指標，進行煙草抗干旱突變體的生理生化鑒定。

2.4 抗旱相關基因的克隆與分析

采用圖位克隆、TILLING技術、基因芯片技術等篩選、克隆抗旱相關基因，并采用半定量PCR與實時熒光PCR技術，對干旱條件下煙草抗干旱突變體材料的滲透調節基因、抗旱相關轉錄因子，以及逆境應答信號因子基因的表達特性進行研究、分析，鑒定煙草突變體的抗旱性。

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