氧化應激與肌萎縮側索硬化的關系

龔夢妮 李小兵 徐仁伵 (南昌大學醫學院，江西 南昌 330006)

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又稱路-蓋里格氏病，是以選擇性侵害上、下運動神經元，皮質、腦干及脊髓的運動神經元進行性死亡為主要特征。在臨床上表現為肌無力、肌肉萎縮、肌束顫動、反射亢進、癱瘓等，最后由于呼吸肌萎縮，呼吸衰竭而死亡。根據其發病的遺傳特點常分為家族型 ALS(familial ALS，fALS)和散發型 ALS(sporadic ALS，sALS)。ALS的發病機制并不是單一獨立的因素造成，而是由多種復雜的因素相互作用所致，主要包括遺傳因素、氧化應激、超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變、谷氨酸興奮毒性、線粒體功能異常、自身免疫異常、外源性毒素或病毒感染、神經微絲的過磷酸化、神經營養因子的缺乏、細胞骨架異常以及蛋白質異常聚積等〔1〕。雖然ALS的發病機制涉及很多方面，但氧化應激在ALS的發病及病情進展中的重要作用已引起廣泛關注。故此，本文就氧化應激與ALS的關系作一綜述。

1 氧化應激與抗氧化防御機制

氧化應激是由于活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)的產生和清除失衡引起〔2〕。氧化應激可造成生物活性分子如蛋白質、脂質、糖類、核酸等氧化修飾，使之喪失原有結構和功能，影響細胞正常生理功能的發揮，最后導致細胞的變性壞死。正常情況下，自由基并不引起機體的病理改變，因機體擁有對抗自由基損傷的酶，如SOD1、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、過氧化氫酶(CAT)及非酶體系防御系統，如非酶類抗氧化物類胡蘿卜素、生育酚和維生素 C以及游離金屬和血紅素結合蛋白。它們可中止自由基鏈式反應，或將自由基變成更低活性物質，使自由基的產生和清除處于平衡。如果自由基的產生超出機體的清除能力，機體就會出現氧化應激〔3〕。

2 ALS氧化損傷的證據

腦組織是機體氧化代謝最活躍的器官，腦組織具有較低的抗氧化劑含量、高密度的膜不飽和脂肪酸、較高的氧化代謝率以及依賴完整的神經元突觸傳遞。與其他組織相比，極易被氧化，特別易于遭受ROS介導的損傷。研究表明，自由基與DNA、蛋白質和脂類反應后的氧化產物可以作為反映自由基水平或者氧化應激的標志物〔4〕。

8-羥基-2-脫氧鳥苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是ROS氧化損傷細胞核DNA或線粒體DNA后形成的產物。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為評價DNA氧化損傷的標志物，通過8-OHdG的檢測可以評價體內氧化損傷和修復的程度、氧化應激與DNA損傷的相互關系，并用來估計氧化應激與疾病的相關性〔5〕。Mitsumoto等〔6〕學者通過對比 50個sALS受試者與46個陰性對照者來研究氧化應激生物標記，運用ELISA技術檢測尿液，發現8-oHdG的水平在sALS受試者中明顯升高;同時應用ELISA和HPLC/ECD(high-pressure liquid chromatography coupled with electrochemical detection)這兩種技術從同一尿樣中檢測8-oHdG水平，發現有統計學意義，證實sALS中氧化應激標記物上調。

蛋白質氧化損傷標志物蛋白質碳基產物在sALS病人的脊髓和運動皮層中明顯增高。Siciliano等〔7〕檢測了49例ALS患者和8名對照者腦脊液(CSF)和血漿中氧化蛋白產物(AOPP)含量，鐵生成能力(FRA)，在CSF中還檢測了2個氧化產物〔4-羥基壬烯酸(HNE)、總亞硝酸鹽和硝酸鹽〕含量。結果發現FRA在ALS的CSF中是降低的，AOPP在血漿和CSF中均升高。AOPP含量在不同ALS臨床類型中不同，在總的ALS患者和ALS脊髓型中升高，在ALS延髓型中幾乎測不出。在ALS中HNE、總亞硝酸鹽和硝酸鹽與正常人中無差異。

過氧化脂質的代謝產物亦產生毒性作用。HNE是脂質過氧化物中最重要的一種產物。活檢ALS和正常人腰髓和皮層，發現ALS患者HNE可以使谷氨酸的轉運蛋(EAAT2)修飾失活，這提示HNE可以促進ALS患者的神經元變性。Shibata等〔8〕用免疫組化和定量酶聯免疫吸附實驗等方法，測得 ALS病人和轉基因小鼠脊髓組織中HNE免疫反應的增強，也提示脂質過氧化產物HNE參與了ALS的發病機制。

2.1 SOD1基因突變與ALS 1993年Rosen等在18個ALS家系中發現ALS1與SOD1基因緊密連鎖，首次在13個ALS1連鎖家系中發現11種SOD1基因突變，從而證實SOD1基因為ALS1的疾病基因。2007年Gruzman等〔9〕研究發現在SOD1基因突變的fALS和sALS患者中都檢測出一種含有SOD1免疫反應的蛋白，表明在fALS和sALS的發病機制中有共同的部分。

SOD1基因定位于21q22.11，基因組DNA全長11kb，含有5個外顯子，編碼一種153個氨基酸的SOD1蛋白。近年研究發現突變SOD1蛋白具有一些特性:(1)突變SOD1的構象不穩定，自身就容易發生折疊;(2)突變SOD1自身的構象存在著錯誤折疊;(3)低聚化的突變SOD1蛋白在體外能夠形成淀粉樣纖維，并且突變SOD1蛋白之間可以借助側鏈相互接觸;(4)突變SOD1蛋白的溶解度下降。

突變SOD1蛋白的毒性作用機制有:(1)氧化應激損傷增加，在fALS動物模型中，突變SOD1被糖基化后可形成更多的過氧化氫(H2O2)，加重細胞氧化應激損傷;(2)興奮性毒性增加，Hu等研究發現在突變SOD1轉基因小鼠的神經系統中谷氨酸轉運體表達減少了，導致細胞外的谷氨酸濃度增加，引起運動神經元死亡;并且在ALS患者的血液和CSF中也存在谷氨酸濃度隨病情進展而升高的現象;(3)啟動了細胞凋亡，突變SOD1在早期可激活基質金屬蛋白酶1(Caspase-1)，觸發前白介素-1β的分泌引起緩慢的細胞凋亡，而在后期可進一步激活Caspase-3直接導致細胞死亡〔10〕;(4)蛋白合成障礙，有研究認為突變的SOD1影響賴氨酸(Lysyl)-tRNA合成酶而導致線粒體蛋白合成功能障礙，進一步引起細胞死亡〔11〕。

2.2 微量元素銅、鐵與ALS 銅是具有氧化還原活性的動物必需的微量元素，它以酶的催化基團或結構輔因子的形式參與多種功能活動，如電子傳遞、氧合與催化等〔12〕。銅容易得失電子，即使在低濃度情況下也具有很強的毒性。銅離子是SOD1活性中心的重要組成部分，SOD1催化超氧陰離子歧化為氧氣和H2O2。H2O2被催化產生大量的高活性和高毒性的羥自由基，羥自由基在體內是最具損傷性的自由基，能使線粒體電子傳遞系統受損、胞內鈣平衡紊亂、蛋白酶作用加強、膜脂質過氧化反應增強，最后導致細胞死亡。G93A-mSOD1轉基因小鼠中發現羥自由基水平的升高。當SOD1沒有結合Zn2+時，SOD1中的Cu2+將一個電子傳遞給O2形成超氧陰離子，與NO反應產生強氧化劑過亞硝酸鹽(ONOO-)。SOD1突變體(mSOD1)的Cu2+易暴露于蛋白分子的結構外，而與ONOO-生成過亞硝酸鹽，后者使其他蛋白質的酪氨酸硝基化，引起后續信號傳導受阻。小鼠模型中給予Cu2+螯合劑如曲恩汀和D-鹽酸青霉胺，在發病初和疾病進程中表現出保護效應。延緩了fALS-G93A轉基因小鼠的發病、延長了其生存期，阻止了表達有SOD1突變細胞的死亡。這也證實銅離子介導的氧化應激參與了 ALS的發病機制。

游離狀態的鐵可通過Haber-Weiss反應催化ROS形成，比如超氧陰離子和H2O2在鐵催化下生成羥自由基，造成氧化應激。ALS病人的CSF中有輕度的鐵水平升高。用激光微探針質譜法對5例sALS病人尸檢后的頸髓標本進行檢測，發現sALS病人頸髓神經元的胞漿和胞核中的鐵比對照組高出1.5～2倍，認為脊髓組織中過量的鐵催化了活性氧的產生，可能在運動神經元變性的發病機制中發揮了重要作用。用蛋白序列方法研究發現SOD1-G93A小鼠晚期與對照組小鼠相比，脊髓勻漿中鐵蛋白重鏈表達增加，說明鐵穩態的改變在ALS發病中發揮了重要的作用。給SOD1-G93A小鼠腹膜內注射鐵卟啉，不論是早期給藥還是癥狀出現時再給藥(與患者開始治療的時間類似)都能明顯改善SOD1-G93A小鼠的運動功能、延長其存活期，經鐵卟啉治療的SOD1-G93A小鼠脊髓中丙二醛(脂質過氧化的標志物)、蛋白羰基(蛋白氧化的標志物)水平明顯下降，神經元存活增加。這一結果進一步提供了在ALS小鼠中氧化損傷參與發病機制的證據。

2.3 線粒體功能障礙與ALS 氧化應激在老化過程中伴有關鍵的作用，并且與線粒體功能障礙有關。新近研究〔13〕發現ALS患者和轉基因ALS小鼠模型的神經與骨骼肌組織均存在線粒體形態和功能異常，通過興奮鈣離子通道途徑減低呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ的活性，從而導致能量代謝障礙，提示線粒體功能障礙與ALS的發生發展有關。目前的多項研究〔14，15〕顯示，線粒體功能障礙是ALS發生、發展的重要因素。Zhou等〔16〕研究發現，散發型ALS患者的肝和脊髓前角細胞中有線粒體形態異常，骨骼肌活檢發現線粒體體積增大、Ca2+濃度增高、線粒體功能受損。基因檢測發現骨骼肌細胞內線粒體DNA異常，推測ALS的線粒體功能障礙是由于其自身缺陷引起的，而非繼發于失神經支配。Muller等〔17〕對SOD1轉基因小鼠研究中發現在去神經支配7 d后，骨骼肌細胞線粒體ROS水平近30倍增高，去神經支配萎縮肌纖維與線粒體ROS有關，ROS增高可能導致線粒體功能障礙。ALS患者骨骼肌中線粒體復合體Ⅳ活性下降，肌肉線粒體蛋白表達降低，線粒體解耦聯蛋白3的表達上調，這提示ALS本身存在骨骼肌線粒體功能障礙。

2.4 星形膠質細胞與ALS 星形膠質細胞是中樞神經系統中的一種主要細胞。它們不僅是對神經元具有結構上的支持和營養之外，而且在中樞神經系統功能的完整性方面具有重要作用。星形膠質細胞通過清除細胞外的谷氨酸和鉀參與了離子平衡，并且與神經元和其他膠質細胞通過相互作用來進行信息交流〔17～19〕。因此，星形膠質細胞對維持神經細胞微環境的穩定和調節代謝過程起重要作用。星形膠質細胞直接和間接參與了多種神經變性疾病損傷的病理過程。在內外因素的作用下，退行性病變的神經元以及過度激活的膠質細胞將導致神經元所處微環境的惡化，使神經元的損傷進行性加重〔18～20〕。

ALS發病中運動神經元損傷使NO和過氧化亞硝酸鹽產生增加，誘導星形膠質細胞活化產生氧化應激，致使營養因子缺乏，促使SOD1突變，導致神經元的退化。星形膠質細胞反應可能是一個程序化的現象。有研究顯示，CSF中的毒性因素刺激了星形膠質細胞的增生。在星形膠質細胞增生的高峰出現時，運動神經元便開始了它的死亡。臨床發作時，星形膠質細胞增生開始增加，同時伴有運動神經元中大量線粒體空泡化。臨床發作后，星形膠質細胞增生的量越多，運動神經元變性就越加重。于此同時發現，ALS轉基因鼠動物模型和患者的脊髓尤其在圍繞受損的上下運動神經元變性的皮質脊髓束周圍均發現明顯的膠質細胞增生。這些活化的星形膠質細胞有共同點:①星形膠質細胞的活化程度與神經元的退變相關，在運動神經元丟失之前即發現運動神經元周圍出現星形膠質細胞反應，表明是病變神經元介導了星形膠質細胞反應。②SOD1包涵體不僅出現在運動神經元中還大量出現于周圍膠質細胞中，表明各種細胞均存在蛋白折疊和處理功能障礙。③星形膠質細胞反應程度與炎性因子、ROS、氮的表達增加和谷氨酸穩態失常有關。

星形膠質細胞比神經元具有更強的抗氧化能力。有證據表明，星形膠質細胞通過分泌谷胱甘肽到細胞外間隙可增加共培養神經元的抗氧化防御能力，從而保護神經元。研究發現，核轉錄相關因子-2-抗氧化反應元件(Nrf-2-ARE)通路激活劑特丁基對苯二酚(Tert-butylhydroquinone，tBHQ)可顯著增加星形膠質細胞谷胱甘肽的合成和分泌，抑制神經生長因子受體p75(p75NTR)依賴的共培養運動神經元的凋亡。應用II相酶誘導劑干預ALS體外器官型脊髓培養模型，可激活 Nrf-2-ARE通路，誘導醌氧化還原酶1(Quinone oxidoreductase1，QOR1)、血紅素氧合酶1(Hemeoxygenase-1，HO-1)等表達上調，降低氧化應激水平，對蘇羥天冬氨酸誘導的選擇性運動神經元損傷具有明顯保護作用〔21〕。此外，SOD1-G93A轉基因小鼠星形膠質細胞選擇性過表達Nrf-2可以增加神經元的抗氧化損傷能力，推遲 SOD1-G93A轉基因小鼠起病時間，延長生存期〔22〕。

3 ALS的抗氧化治療

利魯唑是第一個獲美國FDA和歐盟批準用于治療ALS的藥物。它不僅能抑制神經末端谷氨酸的釋放，還能直接抑制蛋白激酶C，通過抗氧化損傷發揮神經保護作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種高效、無毒的抗氧化劑，具有很強的清除自由基抗氧化的功效，并可以誘導內源性抗氧化酶的表達，對包括ALS在內的神經變性疾病有保護作用。它的抗氧化機制包括:清除ROS;螯合鐵離子;激活細胞內抗氧化防御系統;抑制脂質過氧化反應。

丙酮酸酯作為抗氧化劑和能量的來源，對神經元起保護作用。丙酮酸酯能減輕硝基酪氨酸免疫反應及膠質增生，增加Bcl-2的表達，用丙酮酸酯治療G93A-SOD1轉基因小鼠其生存期延長12.3 d，并可以改善其運動功能〔23〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為谷胱甘肽前體具有很強的抗氧化作用。用NAC治療ALS的動物研究中，發現NAC可延緩SOD1轉基因小鼠運動神經元的變性，且可提高GSH的含量，清除ROS，延長小鼠的生命。在隨機，雙盲及安慰劑對照的研究中，也發現NAC對ALS病人的病程有明顯影響，顯示出NAC對ALS有保護作用的趨勢。此外，乙酰水楊酸鹽、β-胡蘿卜素、維生素E、維生素C等抗氧化劑都具有一定程度的抗氧化治療效果。

4 展望

綜上所述，在ALS病理機制的眾多學說中，目前沒有得到公認的學說，各種機制可能都反映了疾病過程的某一階段或經過。總之，氧化應激在ALS的發病機制中發揮著重要作用，但這方面的工作仍處于起步階段，亟待深入研究。隨著人們對ALS病因學及發病機制的進一步闡述，研究者對機體內環境改變的更深層次的認識，使ALS患者得到早期診斷、早期治療，以延長患者的生命，提高患者的生活質量，以致治愈。

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