7例散發(fā)性Creutzfeldt-Jakob病患者的PRNP和APOE基因突變/變異檢測(cè)及其臨床意義

羅 曼， 李驕星， 孫遜沙， 盛文利

Creutzfeldt-Jakob病簡(jiǎn)稱CJD，其年發(fā)病率約為百萬(wàn)分之一，是以快速進(jìn)展性癡呆為特征，伴有小腦、錐體系和錐體外系受損癥狀和體征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。本病的發(fā)病類型可分為散發(fā)性、家族性、醫(yī)源性和新變異型等4種形式，其中散發(fā)性CJD約占所有CJD的85%［1］。CJD是由一種特殊的具有感染性的蛋白質(zhì)-朊蛋白(prion protein，PrP)所引起，而該蛋白由朊蛋白基因(prion protein gene，PRNP)編碼。另外，載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因的ε4等位基因已被廣泛認(rèn)可與阿爾茨海默病的發(fā)病有關(guān)，鑒于癡呆為CJD的主要臨床表現(xiàn)，國(guó)外學(xué)者對(duì)白種人CJD患者進(jìn)行了APOE基因檢測(cè)，研究表明ε4等位基因可能也是CJD的危險(xiǎn)因子［2］。本研究擬對(duì)中國(guó)漢族人群散發(fā)性CJD患者進(jìn)行PRNP基因及APOE基因檢測(cè)，了解其突變/變異對(duì)散發(fā)性CJD發(fā)病及表型的影響。

1 對(duì)象與方法

1．1 對(duì)象 包括7例散發(fā)性 CJD患者，為2010年8月～2011年8月中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科患者。男性4例，女性3例。發(fā)病年齡為52～76歲，平均62．0±8．2歲。7例患者均進(jìn)行了詳細(xì)的內(nèi)科及神經(jīng)系統(tǒng)專科檢查，并進(jìn)行了腦電圖、MRI、腦脊液14-3-3蛋白等輔助檢查。診斷參照WHO提出的 CJD診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，排除腦血管病、炎癥、腫瘤、外傷、代謝紊亂等疾病引起的癡呆，7例患者均診斷為很可能的(probable)CJD。全部患者無(wú)明確家族史，且均為中國(guó)漢族人群。

1．2 方法 抽取患者外周靜脈血4ml，置EDTA抗凝管中。血樣用血液基因組DNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)提取DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA純度及濃度，二者均合格后保存于－20℃冰箱中備用。參照文獻(xiàn)合成PRNP基因開(kāi)放閱讀 框 架 引 物［4］(F:5’-CAGAGCAGTCATTATGGCGAACCT-3’，R:5’-AGACCTTCCTCATCCCACTATCAG-3’)及 APOE 基因第四外顯子引物［5］(F:5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’，R:5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。以基因組DNA為模板，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增基因片段。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中包括:DNA模板1μl，上、下游引物(20pmol/μl)各 0．25μl，10 × PCR buffer 2．5μl，dNTP(2．5mmol)2μl，Taq 酶(5U/μl)0．2μl，滅菌雙蒸水 18．8μl。PCR 反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性5min，94℃變性 30s，58℃ 或 65℃ 退火 30s，72℃ 延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min。PRNP基因退火溫度為65℃，APOE基因?yàn)?8℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色。目的產(chǎn)物送廣州贏森生物科技有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2．1 PRNP基因測(cè)序 發(fā)現(xiàn)1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K雜合突變(G598A)，經(jīng)反向測(cè)序證實(shí)。結(jié)果(見(jiàn)圖1)。病例1臨床特點(diǎn)為:女性，58歲發(fā)病，亞急性起病，進(jìn)展迅速。以記憶力減退及失語(yǔ)為首發(fā)癥狀，認(rèn)知功能障礙進(jìn)行性加重并逐漸出現(xiàn)小腦癥狀(頭暈、行走不穩(wěn))、錐體外系癥狀(四肢不自主運(yùn)動(dòng))、肌陣攣、緘默。病程2個(gè)月時(shí)出現(xiàn)意識(shí)障礙并逐漸加重。頭部MRI示雙側(cè)扣帶回、雙側(cè)丘腦等T1、T2長(zhǎng)信號(hào)，腦干、小腦未見(jiàn)異常。腦電圖示廣泛性中波幅慢波，左側(cè)顳區(qū)、額區(qū)間斷性類周期性癲癇樣放電，有時(shí)可波及到同側(cè)其他導(dǎo)聯(lián)。送廣東省疾控中心檢測(cè)腦脊液14-3-3蛋白(+)。發(fā)現(xiàn)6例患者PRNP基因M129V多態(tài)性(A385G)均為129基因型MM，僅1例患者(病例2)為129基因型MV，結(jié)果(見(jiàn)圖2)。未發(fā)現(xiàn)國(guó)外報(bào)道［6］的可能與CJD致病相關(guān)的位點(diǎn)突變(G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S)。

圖1 病例1的PRNP基因測(cè)序結(jié)果示E200K雜合突變(G598A)

圖2 PRNP基因M129V多態(tài)性測(cè)序結(jié)果

2．2 APOE基因測(cè)序 發(fā)現(xiàn)1例患者(病例3)存在 APOE基因 ε4等位基因，基因型為 E3/4(ε3ε4)，其余6例患者都未檢測(cè)到該多態(tài)性，即基因型為E3/3(ε3ε3)。病例3臨床特點(diǎn)為:男性，52歲發(fā)病，亞急性起病，進(jìn)展迅速。以小腦癥狀(頭暈、行走不穩(wěn))為首發(fā)癥狀，1w后出現(xiàn)進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能障礙，并逐漸出現(xiàn)錐體外系癥狀(四肢不自主運(yùn)動(dòng))、肌陣攣、緘默。病程1個(gè)月余即出現(xiàn)意識(shí)障礙并逐漸加重。頭部MRI+DWI示雙側(cè)額顳頂皮層DWI不對(duì)稱信號(hào)增強(qiáng)，腦皮層及小腦萎縮。腦電圖示中重度異常，未見(jiàn)周期性放電。送廣東省疾控中心檢測(cè)腦脊液14-3-3蛋白(+)。

3 討論

3．1 PRNP基因致病性突變檢測(cè) 人類PRNP基因位于20號(hào)染色體短臂，共約20kb堿基。它包含2個(gè)外顯子，第一外顯子為非編碼外顯子，第二外顯子含有795bp的開(kāi)放閱讀框架。現(xiàn)有研究表明，散發(fā)性CJD的臨床病理及分子表型在很大程度上會(huì)受到PRNP基因變異的影響［7］。國(guó)外已報(bào)導(dǎo)的位于PRNP基因的CJD致病性突變包括:G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、E200K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S 等，本研究對(duì)7例散發(fā)性CJD患者進(jìn)行了上述位點(diǎn)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K雜合突變(G598A)，未發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)突變。

E200K是全球范圍內(nèi)PRNP基因的最常見(jiàn)突變，它是200位密碼子由GAG突變?yōu)锳AG，導(dǎo)致谷氨酸(Glu，E)改變?yōu)橘嚢彼?Lys，K)。該突變最先在斯洛伐克鄉(xiāng)村的CJD群集病例中發(fā)現(xiàn)［8］，幾乎同時(shí)，利比亞的一個(gè)患病猶太家庭也被檢測(cè)出了該突變［9］。目前，已有超過(guò)10個(gè)國(guó)家在CJD患者中發(fā)現(xiàn)了該突變，該突變的臨床表型除了常具有嚴(yán)重的睡眠障礙外，總體來(lái)說(shuō)與散發(fā)性CJD相似，而睡眠障礙可能與該突變常伴發(fā)顯著的丘腦損傷有關(guān)。2010年，Gao等［10］報(bào)道了我國(guó)首例E200K突變的CJD患者，該例患者同樣以睡眠障礙為典型臨床表現(xiàn)，除此之外與散發(fā)性CJD無(wú)異。次年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心［11］對(duì)2006年～2010年中國(guó)克雅氏病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)獲得的散發(fā)性CJD患者特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)，在所診斷的284例CJD患者中，僅發(fā)現(xiàn)1例E200K突變患者，即2010年Gao等所報(bào)道的病例。本研究所發(fā)現(xiàn)的該例E200K突變患者也具有與散發(fā)性CJD相似的特點(diǎn)，如發(fā)病年齡、進(jìn)展性癡呆、小腦癥狀、錐體外系癥狀、肌陣攣、EEG及MRI改變、腦脊液14-3-3蛋白陽(yáng)性等，這與以往報(bào)道相一致［6，10，12］，但其睡眠障礙并不明顯，我們考慮有以下可能:(1)雖然該患者影像學(xué)檢查也顯示雙側(cè)丘腦損害，但可能在早期損害較輕，未顯示明顯的癥狀;(2)早期的智能障礙部分掩蓋了睡眠障礙癥狀;(3)迅速出現(xiàn)的意識(shí)障礙掩蓋了睡眠障礙癥狀。另外，雖然其家族成員均無(wú)CJD患者，但由于其出現(xiàn)了致病性突變，仍應(yīng)歸為家族性CJD，我們將聯(lián)系其子女進(jìn)行基因檢測(cè)并追蹤其家族成員的發(fā)病情況。

3．2 PRNP基因多態(tài)性檢測(cè) 以往研究顯示，PRNP基因M129V是與CJD易感性相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)［6］。M129V(A385G)多態(tài)性是指 PRNP 基因第129位密碼子可以為編碼甲硫氨酸(Met，M)的ATG，也可以為編碼纈氨酸(Val，V)的 GTG。在正常高加索人群中，37%的人群為 Met/Met(MM)，51%為 Met/Val(MV)，只 有 12%為 Val/Val(VV)［13］。多個(gè)研究均顯示，該位點(diǎn) MM 型與 CJD易感性相關(guān)，在散發(fā)性CJD患者中，MM型所占的比例可以達(dá)到70% ～80%［14，15］;在E200K突變所致的家族性 CJD中，MM型也顯示與 E200K突變相關(guān)［6］。本研究所檢測(cè)的7例CJD患者中共6例為MM型，所占比例高達(dá)85．7%。即使去除診斷為家族性CJD的病例1，剩余的6例患者中MM型所占比例亦達(dá)到83．3%，這與國(guó)外的報(bào)道一致，也與以往針對(duì)中國(guó)散發(fā)性CJD患者的研究結(jié)果一致［11］。

3．3 APOE基因多態(tài)性檢測(cè) 人類APOE基因位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由299個(gè)氨基酸組成，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。最常見(jiàn)的APOE多態(tài)性為ε2/ε3/ε4等位基因多態(tài)性，該多態(tài)性的分子學(xué)基礎(chǔ)為氨基酸序列112位半胱氨酸(Cys)與158位精氨酸(Arg)互換。ε2在這兩個(gè)位置均為Cys，ε4則均為Arg，ε3分別為Cys和Arg。這3種等位基因?qū)е铝巳巳褐写嬖?種不同的基因型，即3種雜合子(E2/3、E3/4、E2/4)和3 種純合子(E2/2、E3/3、E4/4)，其中ε3和E3/3是最常見(jiàn)的等位基因和基因型［16］，而 ε4等位基因已被廣泛認(rèn)可與癡呆有關(guān)。鑒于癡呆為CJD的主要臨床表現(xiàn)，我們對(duì)CJD患者進(jìn)行了APOE基因多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1例患者為E3/4(ε3ε4)基因型，其余6例均為E3/3基因型。該例E3/4基因型患者為所有患者中發(fā)病年齡最小(52歲)、疾病進(jìn)展最快、癥狀較重的，有別于其他E3/3基因型患者。國(guó)外學(xué)者曾對(duì)CJD患者進(jìn)行了APOE基因多態(tài)性及腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(Aβ)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ε4等位基因與腦內(nèi)Aβ沉積相關(guān)，故得出ε4等位基因是加速CJD進(jìn)展的危險(xiǎn)因子的結(jié)論［2］。這可以幫助解釋本研究中E3/4基因型患者發(fā)病早、進(jìn)展快的現(xiàn)象。

本研究結(jié)合既往的研究結(jié)果表明，PRNP基因E200K突變?yōu)镃JD致病性突變，129基因型MM多態(tài)性與散發(fā)性CJD易感性相關(guān)。本研究將1例E200K突變的家族性CJD患者誤診為散發(fā)性CJD患者，鑒于兩者在臨床表現(xiàn)的相似性，對(duì)CJD患者進(jìn)行常規(guī)PRNP基因檢測(cè)將有助于兩者的鑒別，進(jìn)而有助于對(duì)患病家系成員進(jìn)行早期診斷。然而，由于本研究病例數(shù)較少，尚不能肯定APOE基因ε4等位基因?qū)ιl(fā)性CJD進(jìn)展的影響確實(shí)存在，我們將在今后的工作中進(jìn)一步加大樣本量。

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