缺氧后胚鼠神經元自噬及凋亡相關蛋白的表達

陳 艾， 周 暉， 童 煜， 毛 萌

缺血缺氧性腦損傷是兒科常見疾病之一，可累及神經系統發育中的多個區域而遺留永久性的損傷，成活者常遺留腦癱、智力低下等嚴重后遺癥［1，2］。但缺血缺氧性腦損傷的發病機制尚不明確，其有效干預措施也有待探索。自噬是繼壞死、凋亡后發現的第3種細胞死亡形式，被稱為Ⅱ型程序化死亡。自噬、凋亡、壞死3種現象在細胞應激狀態下的發生秩序一直是國內外爭論的熱點。

本研究旨在觀察缺氧致胚鼠神經元損傷后，自噬以及凋亡的發生及變化情況。為進一步研究自噬和凋亡的關系，以及兩者對缺血缺氧性腦病的影響提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 3只17～19d SD孕鼠，清潔級，體質量350～400g，每次使用8只胚鼠，分3次培養神經元。由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供［生產許可證號:SCXK(川)2004-15］。

1．2 主要試劑 多聚-D-賴氨酸、鼠尾膠原(Sigma，美國);高糖培養基、神經A培養基、B-27神經刺激因子、兔源LC3 I/II單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體(賽信通，美國);鼠源actin單克隆抗體、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(中杉金橋，北京);雙抗(100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)、高糖DMEM、10%胎牛血清(Hyclone，美國)。

1．3 主要設備 24孔塑料培養板(潔特生物，廣州)，二氧化碳(CO2)培養箱(Sanyo，日本)，厭氧培養箱(Thermo，美國)，超凈工作臺(Artech，加拿大)。

1．4 原代神經元培養 無菌條件下分離胚鼠大腦皮質，經去除腦膜、胰酶消化后，以1．6～1．8×106/ml的密度接種，接種培養基為高糖DMEM，加10%胎牛血清、1%glutamax、雙抗，放入 37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中。4h后更換為神經元培養基，之后每3d半量換液，至7d神經元成熟。

1．5 神經元缺氧模型的建立 選用培養7d生長良好的神經元，放入國產厭氧培養箱中培養1～6h，厭氧培養條件為 37℃、1%O2。

1．6 蛋白樣品的制備及Western blot檢測 提取細胞總蛋白后用BCA法定量。分別取25μg樣品進行電泳(15%SDS-PAGE)和轉膜(PVDF膜)。先后用 LC3 I/II(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)以及Actin(1∶1000)的一抗和辣根過氧化酶標記的二抗(1∶1000)進行雜交，洗膜后使用Immobilon Western化學發光底物(Millipore，美國)在化學發光成像儀(Bio-Rad公司)中顯影。所得結果用Gel-pro Analyzer軟件分析。

1．7 神經元免疫熒光 選取體外培養7d生長良好的大鼠皮層神經元，吸凈培養基，用預熱的PBS液洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗滌后用 0．2%TritonX-100/PBS 于 4℃ 下處理 15min，5%BSA封閉30min，滴加一抗小鼠源MAP2(1∶200)、GFAP(1∶200)，濕盒中4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加抗小鼠的IgG-FITC(1∶200)，避光室溫孵育1h，DAPI(1∶500)避光1min，PBS充分洗滌后50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。以MAP2陽性細胞占細胞總數的百分比表示神經元細胞純度。

1．8 統計學分析 數據分析采用SPSS13．0軟件，計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0．05，以P＜0．05認為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 皮質神經元的原代培養

2．1．1 神經元形態學觀察 正常神經元呈圓形或橢圓形，胞體發亮，周邊可見明顯光暈，表明細胞活性很好，突觸伸展成多極、雙極，交織成網狀(見圖1A)。OD 3h導致神經元突觸回縮，網狀結構被破壞(見圖1B)。OD 6h后神經元碎片化，突觸膨脹斷裂，網狀結構幾乎消失(見圖1C)。

2．1．2 免疫熒光鑒定 原代神經元鑒定MAP2標記的成熟神經元顯示綠色熒光，熒光顯微鏡下觀察神經元形態結構完整，樹突及軸突舒展(見圖2A)。OD 3h后神經元胞體不再飽滿度，突觸回縮斷裂，網狀結構被破壞(圖2B)。OD 6h神經元感光度降低，突觸膨脹斷裂，網狀結構幾乎消失(見圖2C)。GFAP陽性表達的為星形膠質細胞(見圖2D)，計數十個視野范圍內的100個細胞，星形膠質細胞沾染率＜5%。

2．2 缺氧能明顯誘導自噬現象的發生 缺氧可以明顯誘導自噬的發生。與OD 0．5h皮質神經元對比，隨缺氧時間延長，LC3I向LC3II的轉換明顯增多，尤其在OD 4h時出現高峰，LC3-II/Actin(OD)=0．8228 ±0．012，之后逐漸減弱。至 OD 6h，神經元細胞幾乎碎裂。OD 0．5h～OD 3h與OD 4h～OD 6h的LC3-II/actin均值比較有統計學差異(P＜0．05)。

缺氧明顯誘導自噬發生的同時，凋亡現象也出現。casapase-3表達趨勢在 OD 4h內與 LC3-II一致，但OD 4h～OD 6h時，LC3-II的表達不再增加，出現平臺期，而caspase-3的表達繼續增強(見圖3)。

3 討論

3．1 自噬 自噬是指細胞在自噬相關基因(autophagy related gene，Atg)的調控下利用溶酶體/噬泡降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程［3］。自噬在進化過程中有高度的保守性，是繼壞死、凋亡后發現的第3種細胞死亡形式，參與了如神經退行性改變、精神分裂等多種神經精神疾病的發病過程［3］。自噬可清除受損的細胞器，同時降解被包裹的蛋白質、核酸等成分，產生氨基酸和核苷酸進入三羧酸循環，產生小分子和能量(ATP)，被細胞再利用。這樣就實現了細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬是一種進化保守的細胞反應，它的這種精細調節對維持細胞的自身穩態有重要作用，所以體內幾乎所有細胞中均有基礎水平的自噬現象存在［4］。

事實上，自噬是一個動態的過程，包括3個階段:(1)前自噬泡形成:胞漿中大量膜性結構形成;(2)自噬泡形成:膜性結構包裹受損的細胞器等形成獨立的小泡;(3)自噬泡降解:自噬泡的外膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，最終溶酶體酶逐漸消化被包裹的各種小分子物質，產生能量供機體再利用［5］。在神經元遭受缺氧損傷后，自噬發揮著雙刃劍的作用。一方面，自噬的過度激活可能介導細胞程序性死亡［6］;另一方面，自噬的啟動可能有助于維持神經元穩態，減少繼發損傷，清除已經被損傷的細胞器而保護神經元。

圖1 光鏡結果(×400)

圖2 免疫熒光化學染色(×400)

圖3 OD處理后皮質神經元LC3II及caspase-3的表達趨勢

在所有的Atg蛋白中，目前認為只有LC3/Atg8貫穿于自噬發生的始終，可作為自噬的監測標志［7］。LC3有4種亞型(LC3 I-IV)，其中LC3II因表達最多而成為最廣泛的自噬監測指標。自噬發生時，LC3的C端被Atg4剪切后鏈接一個甘氨酸殘基即成為LC3I，彌散存在于胞質。再通過類泛素化酶反應，催化偶聯磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，成為 LC3-II(LC3-PE)，聚集于自噬體內外膜上。因此，常以LC3II來衡量自噬的發生［8］。

我們已有實驗結果證實，腦細胞對缺氧非常敏感。隨著缺氧時間的逐步延長，神經元死亡及凋亡的比率明顯增加。尤其以缺氧3～5h最為顯著，缺氧6h后，神經元幾乎死亡［9］。因此，我們選擇了神經元缺氧最為敏感的6h內作為觀察時間，在神經元遭受缺氧損傷后應用Western blot檢測LC3蛋白水平的變化以觀察自噬的發生。

我們觀察到，未缺氧處理時，LC3II的表達在OD 0h有一個波峰出現，考慮為細胞在提取蛋白的過程中受到了溫度、缺氧、細胞破碎等劇烈應激變化所致。

缺氧后的細胞，由于已經有0．5h處于應激耐受狀態，可能激發了細胞的穩態，所以 OD 0．5h的LC3II的表達量反而比 OD 0h還低。OD 0．5h～OD4h，LC3II表達相對穩定，處于第一個平臺期(P＜0．05)，OD 0．5h ～OD 4h 組間比較無統計學意義(P＞0．05)。隨著時間的推移，LC3II表達逐漸增加，于OD 4h跳躍式到達峰值，之后在OD 4h～OD 6h處于第二個平臺期，LC3II表達不再上調。OD 4h-OD 6h與OD 0．5h～OD 4h的數值均值比較有統計學意義(P＜0．05)。

我們知道，在臨床工作中，當卒中、新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)等缺血缺氧性腦病發生時，最佳的搶救時間是發病后4h以內，被稱為治療的最佳時間窗。之前尚未有研究提示，缺氧應激后4h之內存在自噬現象的發生。以上數據提示，自噬所介導的信號通路，也是缺血缺氧性腦損傷4h內觸發的瀑布式病理生理機制之一。此實驗結果，佐證了只有盡量爭取在缺氧導致起病4h內［1］，LC3II處于第一個平臺期時，才能得到更好的治療效果。同時，也提示臨床醫生，是否能將LC3II的時間依從性表達趨勢作為臨床判斷缺血缺氧性腦損傷預后的依據之一。

3．2 凋亡 caspase-3是凋亡的標志蛋白，一般認為，只有分子量為35bp的caspase-3被激活成17或19bp的小片段時，才能體現凋亡的發生［10］。因此，我們選取被激活的caspase-3(19bp)為檢測凋亡的指標。從圖3可以看出，缺氧誘導神經元發生自噬的同時，凋亡也被激活，casapase-3(19bp)表達趨勢在OD 4h內與LC3II的表達趨勢一致。但是，當缺氧應激持續存在，在OD 4h～OD 6h時，LC3-II表達量不再升高，而casapase-3(19bp)表達繼續增強。因此，我們認為，當自噬不能維持細胞穩態時，凋亡增強，最終神經元出現壞死。因此，當沒能及時在缺氧應激后4h內得到有效治療的臨床患者，病程后4～6h的治療或許應該以抗細胞凋亡為主。

3．3 小結 目前，對細胞3種程序化死亡現象發生的時間順序仍有爭議［10］，有觀點認為當細胞遭遇應激時，自噬最先被激活，當自噬不能維持細胞穩態后，細胞再繼發凋亡，最后進入壞死，這種順序是不可逆的［11］。也有觀點認為，自噬與凋亡重疊發生，平行執行功能，互為補充，共同維持細胞穩態，抵御應激損傷。本實驗研究發現，細胞自噬與凋亡在某段時間內并存，尤其是在應激后的4h內，這為臨床干預的“時間窗”學說提供新的理論依據。

本實驗研究也提示，既然在缺氧損傷等應激下，細胞會啟動自噬機制來維持自身穩態，提高細胞對低氧的耐受力，那么調控自噬這種細胞自身的促生存機制，或許能夠作為應對缺氧損傷的新策略。如有文獻報道，大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶腦源性神經營養因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)的mRNA及蛋白表達均明顯增加，提示其可能參與了缺血后神經保護［12］，那么，提前應用外源性BDNF可能會改善缺氧應激疾病的預后。

其次，監測LC3II的動態變化，可望作為指導臨床用藥的依據和判斷預后的指標。比如，病程4h內治療以維持細胞穩態，促進自噬為主，預后較好;而當病程進展至4～6h，患者才得以救治的話，治療應該以抗凋亡為主，且預后相對較差。缺氧啟動自噬的信號通路如何，哪些位點參與具體調控，在治療此類腦損傷的過程中，是否能預防性激活自噬、加強自噬的功能以保護神經元，將是我們實驗組下一步研究的內容。

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