HPLC法測定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量

張建國，何 婧

己烯雌酚是人工合成的非甾體雌激素物質，為無色結晶或白色結晶性粉末［1］，可用于絕經期綜合征、卵巢功能不全引起的各種疾病、前列腺癌及老年性陰道炎等，也可用于前列腺癌［2］。目前，己烯雌酚原料及其制劑的HPLC含量測定方法在2010版中國藥典都有記載［3］，也有文獻報道［4-7］。己烯雌酚乳膏是本院臨床長期使用的一種療效優良的醫院制劑，為有效控制本品質量，筆者通過實驗建立了操作簡便、定量準確、專屬性強的HPLC法用于本品的含量測定，獲得滿意結果。

1 儀器與試藥

戴安Ultimate3000型高效液相色譜儀(德國戴安公司);數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100DB);電子分析天平(島津AEU-210型電子天平，d=0.1 mg);己烯雌酚對照品(中國藥品生物制品鑒定所提供，供含量測定，批號:000033-200607);己烯雌酚乳膏及空白基質(批號:20110226，規格:5 mg/25 g，均由東風公司總醫院制劑室提供);甲醇(色譜純);乙醇(分析純);水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(150 mm×2.5 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(70∶30);檢測波長:254 nm;進樣量:20 μL。理論板數按己烯雌酚峰計算應不低于2 000。己烯雌酚與其他雜質峰的分離度:大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 稱取105℃下干燥至恒重的己烯雌酚對照品12.0 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲混勻，作為對照品儲備液(實配0.127 mg/mL)。

2.2.2 樣品溶液的制備 稱取己烯雌酚乳膏20.0 g(批號:20110226，含量:0.21 mg/g)，精密稱定，置錐形瓶中，加無水乙醇適量，超聲處理30 min，放置至室溫，殘渣用無水乙醇洗滌2～3次，將溶液全部轉入100 mL的量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續濾液作為樣品溶液，備用。

2.2.3 空白樣品溶液的制備 取己烯雌酚乳膏基質按“2.2.2”項下樣品溶液的制備方法制成空白樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 空白干擾實驗 按照上述色譜條件，吸取對照品溶液、樣品溶液、空白樣品溶液各20 μL分別注入色譜儀，結果空白樣品溶液中的組分不干擾樣品溶液中己烯雌酚的測定。己烯雌酚峰的保留時間為9.1 min。己烯雌酚峰與其他組分的分離度大于1.5，結果見圖1。

2.3.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取對照品儲備液適量，加無水乙醇稀釋成濃度分別為0.012 7、0.038 1、0.063 5、0.088 9、0.114 0 mg/mL的溶液，按“2.1”項色譜條件，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。以色譜峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，得己烯雌酚的回歸方程:Y=982.3X+1.733 4， r=0.999 7(n=5)。顯示己烯雌酚在0.013～0.114 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 己烯雌酚對照品、樣品及空白樣品色譜圖

2.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL，重復進樣5次，記錄色譜圖。己烯雌酚峰面積RSD為0.79%(n=5)。

2.3.4 穩定性試驗 吸取同一對照品溶液，室溫下分別在0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄色譜圖。結果己烯雌酚峰面積RSD為0.90%，結果表明，供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 稱取己烯雌酚乳膏(批號: 110226)，按“2.2.2”項下平行制備5份樣品溶液，按“2.1”項色譜條件，依法測定，計算含量，結果己烯雌酚的平均含量為0.21 mg/g，RSD為0.99%，結果顯示重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 稱取己烯雌酚乳膏10.0 g，精密稱定，取對照品溶液 (濃度1.03 mg/mL);分別量取1.5、2.0、2.5 mL至樣品中，按“2.2.2”項下樣品溶液的制備方法制成混合溶液，依法進樣20 μL，記錄色譜圖。分別平行3次，計算回收率，具體結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果(n=9)

2.4 樣品含量測定 取3批樣品，分別按“2.2.2”項下方法操作，進樣測定，計算己烯雌酚乳膏中的己烯雌酚含量，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本次實驗同時選擇241、254、260、258、320 nm等6個波長，結果顯示，己烯雌酚在254 nm波長時峰形較好，故選擇該波長。

表2 樣品含量測定結果

3.2 流動相的選擇 預實驗中曾使用過乙腈-水(用磷酸調至不同pH值)系統作為流動相，在這些系統中己烯雌酚峰形不對稱，肩峰，拖尾嚴重，分離度達不到要求。而采用甲醇-水(70∶30)系統峰形對稱，肩峰消失，拖尾因子與分離度均達到要求，穩定性、重現性好。

3.3 樣品的前處理 預實驗結果顯示，在樣品溶液制備中，當加入樣品量過多時，所得樣品溶液呈糊狀，加入樣品量較少時，理論塔板數較低，影響峰形，取己烯雌酚乳膏(批號為110226)20.0 g所制備的樣品溶液較理想。

3.4 己烯雌酚存在順、反兩種異構體，反式體生理活性強，所占比例大，一般制劑多用反式體含量測定代表己烯雌酚含量。在本次實驗中，順式體出峰很小，可忽略，只在注射液中提到順反勢存在動態平衡，己烯雌酚順式體換算因子為1.26，且不能忽略順勢體的含量。

［1］ 黃芬，葉紹輝，龔振明.己烯雌酚的研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2007，34(2):51-54.

［2］ 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學［M］.北京:人民衛生出版社，2007:642.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:38-39，153-156，1029-1031.

［4］ 文遠大，馬柯，趙士冶.高效液相色譜法測復方己唑乳膏中己烯雌酚，氯霉素，甲硝唑的含量［J］.中南藥學，2010，8(11): 832-835.

［5］ 范玉峰，胡守蓮.HPLC法測定己烯雌酚軟膏中己烯雌酚含量［J］.中國醫藥導刊，2010，12(6):1093-1094.

［6］ 王靜，李軍.HPLC法測定己烯雌酚軟膏含量［J］.齊魯藥事，2004，23(9):33-34.

［7］ 白林，張艷秀，陸璐.HPLC法測定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚和羥苯乙酯的含量［J］.解放軍藥學學報，2008，24(2):168-170.