食品和飼料中鐮刀菌毒素的檢測方法

河南科技大學食品與生物工程學院 張勇法

河南科技大學醫學技術與工程學院 楊建英 景愛華

鐮刀菌毒素是鐮刀菌產生的一類次生代謝產物，是影響谷物品質的一個重要因素。受鐮刀菌毒素污染的食物進入動物體后，可抑制機體的免疫系統和生殖系統的功能。目前污染小麥的鐮刀菌毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、伏馬毒素（fumonisin）、單端孢霉烯醇（又稱T-2毒素）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）。目前，我國對鐮刀菌毒素的限量標準還不夠完善，對伏馬毒素和T-2毒素尚無限量。因此，建立快速準確的檢測方法和制定完善的鐮刀菌毒素的限量標準，對提高小麥籽粒的品質，保證食品安全具有重要意義。本文對鐮刀菌毒素檢測方法作一綜述。

1 生物學檢測法

Widestrand等（2003）利用鐮刀菌毒素具有細胞毒性的性質，以5-溴-2'-脫氧尿苷（5-BrdU）生物鑒定來評估谷物提取液對3T3細胞DNA合成的影響，從而判斷谷物鐮刀菌毒素的含量。該方法較為簡單，成本也低，適用于毒素檢測的初步篩選，但其所需時間較長，專一性較差，不能確定一種或多種毒素的存在，也不能準確定量，因此該方法使用范圍有限。

2 物理化學檢測法

2.1 薄層層析法 薄層層析法 （thin layer chromatography，TLC）是毒素檢測的經典方法，本方法具快速、設備簡單、成本低、分離效果好等優點，但靈敏度稍差，并且對研究人員和環境有危害，而且TLC法涉及到一個可視化顏色定量的問題，還是不如氣相色譜和液相色譜方便、準確（蔣木庚和楊紅，1997）。近年來應用較少。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）法通過色譜法對毒素含量進行測定，具有快速、準確、穩定、靈敏度高和自動化等優點，己成為一種極為普及的真菌毒素的檢測手段。鮑蕾等（2005）采用免疫親和柱凈化、柱前衍生結合高效液相色譜法檢測谷物中的T-2毒素，結果表明，方法的檢測限為0.1 mg／kg，相對標準偏差低于9%，回收率為80.0%～95.0%。 Lippolis等（2008）研究發現，用I-NC、2-NC和PCC熒光標記HPLC法測定樣品中的T-2毒素，其檢測限分別為10.0、6.3 ng和2.0 ng。Danyi等（2009）利用HPLC法測定食品添加劑中ZEN及其衍生物，在樣品前處理時比較了酶聯免疫色譜凈化與固相萃取凈化兩種方法對結果的影響，結果發現，前處理采用酶聯免疫色譜凈化法回收率為89%～110%，變異系數較小；而采用固相萃取凈化法回收率較差，且待檢物較易受到萃取柱載體的影響。林維宣等（2001）采用免疫親和色譜法對樣品進行前處理，使用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑測定了醬油中伏馬毒素Bl、B2的含量，結果表明，回收率分別為84.6%～89.2%、60.3%～69.5%，最低檢出限分別為0.01、0.02 mg/kg。最近幾年，液相色譜與質譜聯用技術以及熒光HPLC等的廣泛應用使得HPLC檢測的專一性顯著提高（Meister，2008；Berthiller等，2005）。

2.3 氣相色譜法 氣相色譜法（gas chromatography，GC）法多用于毒素及其代謝產物的微量測定，是分析測定單端孢霉烯族毒素化合物的最理想方法，具有靈敏度高、高分離效能、高檢測效能、分析快速等優點。但是，該方法前處理較繁瑣，需要提純凈化。另外，氣相色譜儀價格昂貴，推廣應用具有一定的局限性。梁穎等（2006）在分析鐮刀菌毒素的同時，還對其衍生化試劑及衍生條件進行了比較研究，結果發現，氟化衍生后檢測靈敏度較高，而硅烷化衍生不需加熱，在室溫下即可完成，且生成物穩定。此外，ROMER公司推薦了乙腈-水（84:16，V/V）作為提取溶劑，該提取溶劑在目前鐮刀菌毒素分析中使用比較廣泛（Berthiller等 ，2005；Bily 等 ，2004；Eke等，2004）。目前，DON、T-2、ZEN和伏馬毒素的免疫親和柱均已商品化，被廣泛應用于4種毒素的定量分析中（李軍等，2006；隋凱等 2006）。

2.4 色譜-質譜聯用法 質譜與氣相色譜（gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS） 或液相色譜聯用 （liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS），能增強鑒定的可靠性，具有專一性強，靈敏度高等優點。但由于只有專業測試或研究機構中心才具備其設備，而且存在前處理較為繁瑣，需要對樣品進行提取、凈化和濃縮等應用瓶頸，所以并不適用于日常檢測，普及具有一定困難。羅毅等（1998）建立的鐮刀菌毒素的電子捕獲GC-MS法，檢測T-2毒素的最低限為5×10-11g。該法不僅能檢測低含量的化合物，而且能確定混合物中的某一化合物，廣泛應用于T-2毒素以及其他真菌毒素的檢測，但是昂貴的設備限制了該法的廣泛使用。Mateo等 （2002）建立了對DON、NIV、ZEN、T-2和伏馬毒素 5種鐮刀菌毒素的LC-MS檢測法。劉承蘭等（2005）采用LC-MS/MS法測定了玉米和蘆筍中的伏馬毒素B1、B2的含量，樣品前處理采用固相萃取法凈化，最低檢測限為80 pg，回收率為78.3%～104.9%。

3 免疫學分析法

3.1 酶聯免疫吸附法 曹艷紅等（2006）采用直接競爭性ELISA法檢測谷物中T-2毒素，結果表明，該方法最低檢出量為0.125 ng/mL，添加70～280 ng/g T-2毒素的大米樣品和面粉樣品的平均回收率分別為85%～117.5%和98.1%～102.5%。競爭ELISA法是測定小分子抗原的方法，尤其適用于食品安全中鐮刀菌毒素的檢測（陳愛華和楊堅，2004）。Pal等（2004）建立免疫過濾膜法檢測T-2毒素的方法，該免疫過濾膜上分布著36種抗體點區域，試驗利用T-2毒素-辣根過氧化物酶（T-2 toxin-HRP）作為示蹤分析物，以4-氯-1-萘酚作為底物，結果表明，該方法可以快速簡便的檢測出小麥和家禽飼料中的T-2毒素，檢測敏感度分別為 12.5 mg/kg和 25 mg/kg。

3.2 放射免疫法 Ler等（2006）研究報道，利用放射性標記的三明治免疫學熒光化學發光和電化學發光檢測法改進ELISA法，檢測T-2毒素，可以提高檢測敏感度。宋康泰等（1987）合成了T-2毒素的人工抗原T2-BSA和3H標記的T-2毒素，用T2-BSA免疫家兔獲得的高質量的抗血清，與3H標記T-2毒素的親和常數為3.2×109M-1，終滴度為l∶2000，測定水中T-2毒素的最低檢出限為1.0 ng/mL，測定血和尿的樣品時最低檢出限為2.0 ng/mL。然而，由于放射免疫有一定的危險性，影響人身體健康，因此，該方法未被廣泛應用。

3.3 免疫熒光法 熒光免疫分析（Fluoroimmunoassay）的方法很多，如熒光偏振免疫分析、熒光猝滅免疫分析、熒光增強免疫分析、時間分辨熒光免疫分析等。Lippolis等（2011）針對T-2毒素及其代謝物HT-2毒素建立了免疫熒光檢測方法。免疫熒光法檢測鐮刀菌毒素，能夠達到ng甚至pg的檢測水平。

4 T-2毒素的其他檢測法

由于以上方法只能檢測一種T-2毒素，而T-2毒素的代謝物HT-2也常常存在于污染的谷物中，為了滿足實際檢測的需要，Visconti等（2005）建立了一種可以同時檢測T-2和HT-2毒素的靈敏精確的新方法，即熒光標記的高效液相色譜法，免疫親和凈化后，1-antroylnitrile（1-AN）作為標記試劑，T-2毒素和其代謝物HT-2檢出率分別為5 μg/kg和 3 μg/kg。 此外，Li等（2009）用桔林油脂酵母α-淀粉酶基因插入可以表達人體細胞色素P4503A4和同源的人CYP 450還原酶的啤酒酵母中。將該菌株和葡聚糖表達菌株用于微孔板真菌毒素生物學檢測試驗，用甲醇作溶劑，多粘菌素B九肽作為滲透促進劑；通過熒光檢測糖酶的分泌受到抑制程度顯示其毒性，可以檢測T-2毒素的最低劑量為100 ng/mL。

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