雞球蟲重組活載體疫苗研究進展

杜金粉，楊文濤，楊桂連，王春鳳

(吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118)

雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的一種細胞內寄生蟲病，嚴重影響養雞業的健康發展。全球每年因雞球蟲病造成的經濟損失難以估計，抗球蟲藥物研發和使用的費用數額巨大。目前，化學藥物預防仍是養雞業控制球蟲病的一個主要方法，但化學藥物的長期使用導致球蟲產生耐藥性、藥物殘留等一系列問題。應用傳統疫苗如弱毒蟲苗免疫預防球蟲病雖然有一定效果，但存在毒力返強和散播病原的可能。因此通過基因工程方法制備基因工程新型疫苗預防雞球蟲病成為大勢所趨，重組活載體疫苗是用基因工程技術將病毒或細菌構建成一個載體，把外源基因插入其中使之表達的活疫苗，其中以細菌或病毒為載體的基因重組活載體疫苗的研究倍受關注。本文對雞球蟲重組活載體疫苗的研究進行綜述，旨在為雞球蟲免疫預防提供參考。

1 重組細菌活載體球蟲疫苗

細菌載體具有培養方便，外源基因容納量大，刺激細胞免疫力強等優點。同時起佐劑作用，刺激產生強的B細胞和T細胞免疫應答［1］。目前應用到球蟲上的細菌活載體主要有沙門氏菌、卡介苗、乳酸菌、枯草桿菌等。

1.1 減毒沙門氏菌活載體疫苗 沙門氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌、腸桿菌科。沙門氏菌的減毒是利用物理、化學或基因工程的方法，使某個或某些基因發生不可逆的突變，從而降低其毒力。減毒沙門氏菌作為一種活疫苗載體，既能保持持久的免疫刺激而不需要反復加強免疫，又能有效激發體液和細胞免疫［2］。目前減毒沙門氏菌被廣泛應用于新型疫苗的研制且顯示出廣闊應用前景。Konjufca等將柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)抗原SO7基因在減毒鼠傷寒沙門氏菌進行了表達［3］。覃宗華等［4］構建了毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)MIC2基因、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)cSZ1基因雙基因共表達的重組減毒沙門氏菌，將重組減毒沙門氏菌經口免疫雛雞后能誘導產生抗雞球蟲重組抗原的特異性IgG和IgA。免疫后3周試驗雞以同源 E.necatrix和E.acervulina攻擊，可同時獲得部分保護。杜愛芳等［5］將 E.tenella 5401 基因的真核表達質粒pcDNA3－5401，高壓電轉化到dam和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門菌中。將其口服接種于3日齡雛雞，2周后用相同劑量加強免疫1次，二免后2周用E.tenella孢子化卵囊攻擊。結果表明重組菌既能誘導產生抗E.tenella抗體，也能顯著增強淋巴細胞增殖水平，其抗球蟲指數(ACI)為164.98。

1.2 重組卡介苗活載體疫苗 卡介苗(BCG)是一種強免疫佐劑和非特異性免疫增強劑，并且熱穩定性強、副作用小、易于生產，因此是表達重組外源基因的理想活菌疫苗載體。重組卡介苗(rBCG)是利用基因工程技術在BCG中導入外源基因，在rBCG中可表達病毒、細菌、寄生蟲的抗原以及細胞因子等許多活性蛋白。Wang Q等［6］構建了含有E.tenella rhomboid基因的 rBCG pMV261－Rho和pMV361－Rho，分別將其免疫雛雞后能誘導雛雞產生較高水平的CD4+和CD8+，pMV261－Rho免疫組能誘導雞產生抗E.tenella特異性抗體，56.04%的雞能抵抗E.tenella孢子化卵囊的攻擊，其抗體滴度與免疫后獲得的保護率均高于pMV361－Rho免疫組。李運娜等［7］構建的雞柔嫩艾美耳球蟲ADF基因重組卡介苗pMV261－ADF和pMV361－ADF對柔嫩艾美耳球蟲卵囊的攻擊具有一定的免疫保護作用。苑淑賢等［8］構建堆型艾美耳球蟲長春地方株pMV361－cszl重組質粒并在BCG誘導表達rBCG及檢測免疫保護效果。

1.3 乳酸菌載體疫苗 乳酸菌是動物腸道內的常在菌，在動物體內長期存在，可以調節機體內環境的免疫狀態，增強細胞免疫和體液免疫功能，從而發揮其抗感染的作用。乳酸菌具有諸多的益生功能，可控制腸道感染、抗腫瘤、促進小腸局部細胞免疫和體液免疫，產生黏膜分泌型IgA等。何高明等［9］研究了乳酸桿菌對雛雞巨型艾美耳球蟲(E.maxima)感染的影響，發現乳酸桿菌可減輕E.maxima對雛雞腸道產生的損傷，說明乳酸菌本身對雞球蟲有很好的保護性效果。乳酸桿菌作為活疫苗抗原遞呈載體具有很好的安全性，用其作為載體制備雞球蟲重組活載體疫苗可將乳酸菌的益生功能和保護性抗原的保護效果集于一身，具有廣闊的應用前景。Yang等［10］將E.tenella SO7基因重組入大腸桿菌－乳酸菌穿梭表達載體，進而將重組菌免疫雛雞后攻蟲。結果顯示與照組相比，免疫組雛雞體重明顯增加、發病率下降，盲腸病變計分顯著降低。外周血中CD4+、CD8+T細胞的數量顯著增加，表明該重組菌顯著增強了雞體細胞免疫水平。該重組菌對E.tenella具有很好的保護效果，為球蟲乳酸菌重組活載體疫苗研究奠定了基礎。徐鑌蕊等［11］將E.tenella保護性抗原基因SO7導入乳酸桿菌表達載體并將重組菌免疫肉仔雞。結果表明飼喂轉基因乳酸菌組雛雞受球蟲攻擊的組織病理學變化較輕，從而證明該重組乳酸菌對球蟲感染具有一定的保護作用。王春鳳等［12］將含有 E.tenella SO7基因的重組乳酸菌免疫雛雞，發現該重組乳酸菌對攻蟲后的雛雞具有較好的增重效果，且可顯著降低盲腸病變計分，顯示了對雞球蟲很好的保護效果。張莉［13］將表達E.tenella TA4基因的重組乳球菌口服雛雞十天，人工感染E.tenella一周后宰殺，通過增重、糞便中卵囊數、盲腸病變計分、盲腸卵囊數和抗球蟲指數等指標進行評價。結果ACI為160.12，能較好保護球蟲感染。

1.4 枯草芽孢桿菌載體疫苗 枯草桿菌廣泛應用于工業發酵和微生物分子遺傳學領域。該菌不產生毒素，是一種無致病性的安全微生物，具有完善的分泌系統，能將外源重組蛋白直接分泌至培養液中，大大減少了表達產物的分離純化步驟，提高了回收率，現已應用于許多蛋白的表達［14］。黃現青等［15］研究了枯草芽孢桿菌fmbJ株產生的脂肽的抗球蟲作用，研究表明感染不用藥組、抗球蟲藥飲水組、灌胃和肌肉注射脂肽組對E.tenella的ACI分別為18.71、185.45、161.40 和 109.83。結果顯示枯草芽孢桿菌fmbJ株產生的脂肽具有一定的抗球蟲效果。Lee等［16］將芽孢桿菌飼喂雛雞，攻蟲后發現該類細菌可有效保護雞體抗球蟲感染，這為雞球蟲枯草芽孢桿菌活載體疫苗研究奠定了基礎。

2 重組病毒活載體球蟲疫苗

病毒活載體疫苗是疫苗研發的重要方向之一，因為它有免疫效力高、成本低及安全性好等優點。目前，主要的病毒活載體有牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、人2型和5型腺病毒、火雞皰疹病毒、偽狂犬病病毒、水痘－帶狀皰疹病毒、微RNA病毒、黃病毒和脊髓灰質炎病毒等。Yang等［17］構建了含有E.tenella rhomboid基因的重組雞痘病毒rFPV－rhomboid，將其免疫3日齡雛雞，結果免疫組無論從卵囊記數、盲腸病變記分，還是相對增重、抗體產生以及細胞免疫水平均優于空白對照組。當分別用102、104和106PFU不同的劑量免疫雛雞，E.tenella孢子化卵囊攻蟲，其保護率分別為39.6%、41.1%和41.7%。有關重組病毒活載體疫苗的研究相對較少，還有待進一步研究。

3 結語

總之，近年來雞球蟲基因工程疫苗發展迅速，其中是以細菌和病毒為載體的重組活載體疫苗研究非常活躍，此種疫苗的研究為雞球蟲病免疫預防提供了新途徑。但這些疫苗尚處在試驗研究階段，還有一些瓶頸技術有待解決，例如載體的優化，球蟲保護性抗原基因的篩選等。但隨著分子生物學和基因工程技術的發展和球蟲免疫學研究的不斷深入，以上問題都會逐步得到解決。

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