小鼠腦缺血神經(jīng)功能障礙行為學(xué)評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展

高 志，趙海蘋(píng)，羅玉敏，吉訓(xùn)明

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，腦血管病研究室，北京100053)

缺血性腦卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率及高致死率的疾病。在腦缺血及腦缺血-再灌注損傷的研究中，最常使用大鼠或者小鼠的可逆性大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。由于小鼠的基因型與人類(lèi)更相似［1］，因此小鼠MCAO模型在研究腦缺血及再灌注損傷病理生理變化及基因表達(dá)方面有著更大的優(yōu)勢(shì)［2］。腦梗死體積與神經(jīng)功能缺損的行為學(xué)評(píng)價(jià)是判定腦缺血嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，許多研究報(bào)告對(duì)大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行了闡述［3，4］，而對(duì)小鼠的研究較少，其評(píng)價(jià)指標(biāo)大多移植于大鼠的評(píng)價(jià)體系，至今為止，還沒(méi)有對(duì)這一系列的綜合性評(píng)價(jià)達(dá)成共識(shí)，不僅有許多不同的測(cè)試在使用，而且所應(yīng)用測(cè)試的數(shù)量和頻率也沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文對(duì)小鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷評(píng)價(jià)方法包括感覺(jué)功能、運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)能力以及綜合性評(píng)價(jià)做一綜述。

1 感覺(jué)功能評(píng)價(jià)

小鼠MCAO模型中，感覺(jué)功能的缺失是對(duì)其神經(jīng)功能判定的一個(gè)可靠的指標(biāo)［5］。目前最常用的是墻角試驗(yàn)(corner test)，最先由 Schallert等［6］提出，后經(jīng)Zhang等［7］改良，具體操作是將兩個(gè)尺寸為30cm ×20cm ×1cm的紙板呈30°夾角放置，將小鼠置于夾角之間，進(jìn)入夾角深部，雙側(cè)的觸須受到刺激后會(huì)站立并轉(zhuǎn)身面向夾角的開(kāi)口端。正常小鼠從右面或左面轉(zhuǎn)身的概率基本相等，而一側(cè)腦損傷小鼠會(huì)優(yōu)先向腦損傷側(cè)轉(zhuǎn)身。墻角試驗(yàn)可以準(zhǔn)側(cè)檢測(cè)出感覺(jué)功能障礙，甚至90d后的輕度局灶性腦缺血，特別是在紋狀體發(fā)生缺血時(shí)。此實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，應(yīng)用廣泛，但 Li等［8］認(rèn)為墻角試驗(yàn)對(duì)感覺(jué)功能恢復(fù)程度的檢測(cè)不敏感，可能是因?yàn)檫@項(xiàng)試驗(yàn)是對(duì)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能的綜合評(píng)價(jià)，需要兩種功能都較好的恢復(fù)后才能檢測(cè)出來(lái)，而且不能準(zhǔn)確反映單側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)功能變化。

粘簽試驗(yàn)(sticky dot test)又稱(chēng)感覺(jué)不對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)，用來(lái)確定皮膚敏感性和感覺(jué)功能的整合性。當(dāng)缺血發(fā)生在大腦皮層的感覺(jué)區(qū)、皮質(zhì)脊髓束和紋狀體時(shí)，感覺(jué)功能發(fā)生明顯缺失。具體方法是將直徑5mm的圓形背膠標(biāo)簽貼附在小鼠相對(duì)無(wú)毛的手腕處，當(dāng)回到飼養(yǎng)籠時(shí)，一個(gè)正常的小鼠會(huì)用牙齒迅速除掉每個(gè)圓形標(biāo)簽，而發(fā)生腦缺血的小鼠首先除掉附著在正常前肢的標(biāo)簽，然后是病變的一側(cè)，并需要花費(fèi)更多的時(shí)間，缺血性病變導(dǎo)致了感覺(jué)功能的不對(duì)稱(chēng)性［9］。此外，時(shí)間的延遲還表明運(yùn)動(dòng)功能的缺失，嘴和前肢運(yùn)動(dòng)障礙導(dǎo)致去除粘性標(biāo)簽相對(duì)困難。后續(xù)的測(cè)試可以通過(guò)逐步增加患側(cè)所粘標(biāo)簽的大小并減小健側(cè)的標(biāo)簽大小，直到患側(cè)肢體所受的的刺激變得比健側(cè)的更突出，小鼠就開(kāi)始首先從患側(cè)的肢體消除刺激［10］。該方法主要用于對(duì)多種病因?qū)е碌那爸杏X(jué)、皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)損傷后的功能評(píng)價(jià)，與人類(lèi)頂葉受損后對(duì)側(cè)肢體的忽視癥狀類(lèi)似。

圓筒試驗(yàn)(cylinder test)又稱(chēng)肢體不對(duì)稱(chēng)使用試驗(yàn)，最早應(yīng)用于大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)［9］，Kadam等［11］通過(guò)改良用來(lái)評(píng)估小鼠前肢使用和旋轉(zhuǎn)的對(duì)稱(chēng)性，當(dāng)小鼠一側(cè)的感覺(jué)皮層、皮質(zhì)脊髓束、紋狀體受到缺血損害時(shí)前肢的使用發(fā)生不對(duì)稱(chēng)性，進(jìn)一步觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)離散運(yùn)動(dòng)障礙和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)也相繼發(fā)生［12］。具體操作是將小鼠放置在一個(gè)直徑9cm，高度15cm的透明圓桶內(nèi)。當(dāng)小鼠后腿站立時(shí)，分別記錄最初左前肢、右前肢及兩側(cè)前肢同時(shí)碰觸筒壁的次數(shù)。當(dāng)一側(cè)前肢(如右側(cè))碰觸筒壁后，另一側(cè)前肢(左側(cè))在右側(cè)未移開(kāi)時(shí)也碰觸到了筒壁，記錄一次右側(cè)和一次同時(shí)碰觸。當(dāng)兩側(cè)前肢交替碰觸筒壁時(shí)，記錄為同時(shí)碰觸，共進(jìn)行20次重復(fù)試驗(yàn)。最終得分=(右前肢的運(yùn)動(dòng) -左前肢運(yùn)動(dòng))/(右前肢運(yùn)動(dòng)左前肢運(yùn)動(dòng))×100%。得分越高說(shuō)明兩側(cè)肢體的不對(duì)稱(chēng)程度越明顯。這種評(píng)分方法即使對(duì)于沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)者也有較高的可信度。

2 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

運(yùn)動(dòng)功能的不協(xié)調(diào)性和伴隨出現(xiàn)的的代償反應(yīng)是人類(lèi)中風(fēng)的突出特點(diǎn)。大部分腦缺血的動(dòng)物模型都會(huì)在行走、轉(zhuǎn)彎和游泳等運(yùn)動(dòng)中出現(xiàn)相應(yīng)的功能障礙。Whishaw等［13］在1986年建立了一種大鼠以前肢通過(guò)窄縫抓取食物的評(píng)價(jià)方法，稱(chēng)為伸爪試驗(yàn)(skilled reaching test)。該方法可評(píng)價(jià)單側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)功能，區(qū)分肢體損傷與修復(fù)的細(xì)小差別［14］，還可以用來(lái)評(píng)估感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層和皮質(zhì)脊髓束的功能缺失［15，16］，對(duì)小鼠同樣適用。伸爪實(shí)驗(yàn)盒用透明玻璃制成，長(zhǎng)寬高分別為20cm，6cm和20cm，在盒的前壁正中央開(kāi)一條寬度為0.5cm狹長(zhǎng)的縫隙，縫隙底部前壁的外側(cè)有放置食物片的凹槽，迫使小鼠從縫隙處伸出患側(cè)前肢抓取食物。正常小鼠可從縫隙處伸出前肢，抓取并吃到凹槽內(nèi)的食物；而腦缺血后的動(dòng)物不能完成。伸爪實(shí)驗(yàn)可較穩(wěn)定的反映腦缺血慢性損傷變化，對(duì)動(dòng)物伸爪、抓食及吃食過(guò)程可作細(xì)致的軌跡分析，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)更多的變化特征［17］。

煙囪試驗(yàn)(chimney test)最早由 Boissier等提出，后經(jīng) Heinecke等［18］改良，具體發(fā)方法是在一根長(zhǎng)25cm，直徑30mm的透明玻璃管的20cm處作一個(gè)記號(hào)，水平放置，將小鼠放置于入口處，當(dāng)其爬至管底時(shí)，將玻璃管垂直放置，使其頭朝下，正常狀態(tài)下小鼠會(huì)通過(guò)快速反應(yīng)學(xué)會(huì)倒著走路，到達(dá)標(biāo)記處所需的時(shí)間最長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)120s，而發(fā)生腦缺血后所用時(shí)間會(huì)明顯延長(zhǎng)，此實(shí)驗(yàn)常用來(lái)測(cè)試小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。立柱試驗(yàn)(vertical pole test)主要對(duì)前肢的力量，抓握能力和平衡性進(jìn)行評(píng)估［19］。由 Paylor等［20］提出并改進(jìn)了評(píng)分方法，將一根長(zhǎng)15英寸、直徑0.75英寸的木棍用膠帶纏繞，以增加摩擦力，水平放置后將小鼠放在木棍中央，將木棍慢慢抬起直至與地面垂直，記錄小鼠在木棍上的時(shí)間，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，在木棍垂直之前已掉落；1m in，時(shí)間＜20s；2分，20s＜時(shí)間＜40s之間；3m in，40s＜時(shí)間＜60s；4m in，＞60s。Hernandez等［21］提出的前肢踩空試驗(yàn)(foot-fault test)也可用于前肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)價(jià)，將小鼠放置在不同尺寸的6邊行的鐵絲網(wǎng)上，小鼠在鐵絲上行走，在此過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)踩空或踩滑現(xiàn)象，記錄前肢總共行走的次數(shù)以及踩空的次數(shù)，踩空的次數(shù)越多表明小鼠腦損傷越大。爬板試驗(yàn)(climbing board test)［22］是將小鼠置于一塊包有銅絲網(wǎng)的有機(jī)玻璃平板上，先保持平板在水平位置，后逐漸將平板豎起，至小鼠不能攀爬而從平板上落下，記錄此時(shí)平板軸線與水平面之間的角度，即爬板角度，重復(fù)三次取平均值。爬板試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)整體協(xié)調(diào)功能，也是一種簡(jiǎn)便且可定量的指標(biāo)，但是，該指標(biāo)變化的恢復(fù)較快，僅能用于3d內(nèi)的急性功能損傷。

為了提高神經(jīng)功能行為評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性及可信度，近年來(lái)各種發(fā)明及改良的裝置、軟件層出不窮。旋轉(zhuǎn)加速試驗(yàn)(accelerated rotarod test)首先用于研究神經(jīng)系統(tǒng)功能的運(yùn)作，后來(lái)才在腦損傷如腦缺血的研究中廣泛應(yīng)用［23］，主要用來(lái)評(píng)估腦缺血?jiǎng)游镞\(yùn)動(dòng)的平衡和協(xié)調(diào)能力。Ahmad等［24］在研究中將其稱(chēng)為“旋轉(zhuǎn)跑步機(jī)測(cè)試”，動(dòng)物放置在直徑3cm的圓形轉(zhuǎn)盤(pán)的中央，轉(zhuǎn)盤(pán)與一個(gè)可調(diào)節(jié)速度的轉(zhuǎn)軸連接，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后轉(zhuǎn)軸在1分鐘內(nèi)從0加速到24轉(zhuǎn)，記錄小鼠在圓盤(pán)上的時(shí)間，最大分值為60，腦缺血的嚴(yán)重程度與得分成反比。為了排除試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的偶然情況，每只動(dòng)物可做3次測(cè)試，取平均值作為最終得分。此法操作簡(jiǎn)單，可行性大，且靈敏度較高。曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field)需要一曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)敞箱的裝置［25］，木質(zhì)，周壁及底面涂黑，底面由面積相等(10cm×10cm)的方格組成，將小鼠放入曠場(chǎng)正中格，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5min的行為變化，包括水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)及糞便粒數(shù)，數(shù)據(jù)用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)軟件分析。該試驗(yàn)不僅可以用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，也可用糞便粒數(shù)反應(yīng)動(dòng)物的焦慮狀態(tài)［26］。懸掛試驗(yàn)(hanging test)最早開(kāi)始于大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)，后經(jīng)Muhammad等［27］的改進(jìn)成功應(yīng)用于小鼠，該試驗(yàn)［28］是將小鼠尾部1cm處用膠帶粘貼懸掛于墻上，用攝像設(shè)備記錄小鼠1m in內(nèi)在墻上運(yùn)動(dòng)情況，輸入計(jì)算機(jī)保存圖像。用計(jì)算機(jī)軟件處理平均角、優(yōu)勢(shì)角和轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)等參數(shù)，并計(jì)算出相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)值。懸掛試驗(yàn)可以反映小鼠的偏癱癥狀、運(yùn)動(dòng)和平衡能力，與梗死面積有較好的相關(guān)性，可客觀的反應(yīng)腦缺血損傷及神經(jīng)癥狀［29］。

3 學(xué)習(xí)與記憶能力評(píng)價(jià)

人類(lèi)腦卒中的發(fā)生經(jīng)常伴隨著認(rèn)知與記憶功能障礙，因此在腦缺血的動(dòng)物模型中也需要對(duì)認(rèn)知、記憶功能進(jìn)行檢查。常用的評(píng)估方法包括水迷宮和跳臺(tái)試驗(yàn)。水迷宮最初由Morris等［30］提出，最先應(yīng)用于大鼠的認(rèn)知功能評(píng)價(jià)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它對(duì)小鼠［31］和人類(lèi)［32］同樣適用。將測(cè)試小鼠放置于直徑2m的游泳池中，通過(guò)其視覺(jué)記憶找到隱藏于水下1cm的平臺(tái)，如果找不到，表明其記憶受損，其損傷程度可用找到平臺(tái)所需的時(shí)間進(jìn)行量化，平臺(tái)的位置也可每天變化。當(dāng)小鼠的前額葉皮層、紋狀體、小腦受損傷時(shí)測(cè)試結(jié)果明顯，對(duì)海馬損傷尤其敏感。水迷宮操作簡(jiǎn)單，可信度高，在國(guó)內(nèi)外使用較多。旋臂迷宮試驗(yàn)(radial arm maze)可用于評(píng)估腦缺血?jiǎng)游锏膶W(xué)習(xí)和記憶功能障礙，同樣對(duì)海馬的損傷尤為敏感［33］。其實(shí)驗(yàn)裝置包括一個(gè)中央平臺(tái)及由平臺(tái)向四周突出的八個(gè)或十二個(gè)徑向臂［34］。試驗(yàn)開(kāi)始之前，將食物放置在某一徑向臂的末端，動(dòng)物需禁食一段時(shí)間，以保持一定的覓食動(dòng)力。試驗(yàn)將小鼠放置在平臺(tái)上，依靠其空間感來(lái)尋找食物，完成任務(wù)后將其放回平臺(tái)中央，依靠記憶功能重新尋找食物，為了增加困難，可將食物放在其他徑向臂的末端，記錄犯錯(cuò)誤的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦缺血小鼠的學(xué)習(xí)與記憶障礙明顯。

跳臺(tái)測(cè)試(step-down test)［35］需要用到小鼠跳臺(tái)儀，此裝置用黑色有機(jī)玻璃分割成5間，箱底放置銅柵，每間右后角置一高3cm，直徑4cm的橡皮墊作為動(dòng)物逃避電擊的安全區(qū)，實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠放置在橡皮墊上，通36V交流電，小鼠跳至銅柵上時(shí)會(huì)受到電擊，正常反應(yīng)是跳回安全區(qū)以躲避電刺激。時(shí)間持續(xù)5min，記錄每只小鼠受到電擊的次數(shù)作為記憶成績(jī)。此實(shí)驗(yàn)受人的主觀意識(shí)影響較小，能夠客觀的評(píng)價(jià)小鼠記憶能力。此外，測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的方法還有避暗試驗(yàn)、T形迷宮試驗(yàn)、穿梭箱試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)等。

4 綜合性評(píng)價(jià)

國(guó)際腦卒中治療臨床前研究指南(STAIR)指出，在腦缺血治療藥物研究中，多重指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)很重要，各種行為學(xué)的結(jié)果都應(yīng)該評(píng)價(jià)［36］。目前，國(guó)內(nèi)外主要采用 Longa五分法［22］對(duì)小鼠進(jìn)行綜合性評(píng)分(以右側(cè)腦缺血為例)，即0分，無(wú)明顯神經(jīng)功能損害癥狀；1分，左肢體不能完全伸展；2分，行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向右側(cè)傾倒；4，不能自發(fā)行走；5分，死亡。另外Bederson等［37］提出的3級(jí)評(píng)分方法和以后改良的4分和5分法［38］的癥狀評(píng)分法也被大多國(guó)內(nèi)外研究者采用，上述兩種評(píng)分方法操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間，但都存在主觀性較大，結(jié)果不夠客觀的缺點(diǎn)，并且評(píng)價(jià)不夠全面，評(píng)分不夠細(xì)致。Clark評(píng)分［39］分別從局灶性功能損傷和一般功能損傷兩個(gè)角度對(duì)小鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行了綜合性評(píng)價(jià)，總分為28分，它通過(guò)對(duì)毛發(fā)、耳朵、眼睛、體態(tài)等細(xì)微的觀察，以及步態(tài)、攀爬、身體對(duì)稱(chēng)性、自主運(yùn)動(dòng)和癲癇發(fā)作的測(cè)試進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并且與腦梗死體積的比例具有良好的的相關(guān)性。Garcia JH評(píng)分［40］與Clark評(píng)分相似，最早應(yīng)用于大鼠，是對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能的綜合性評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)改良，也可對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，缺血性卒中引起的腦損傷通常與運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和認(rèn)知功能障礙等相關(guān)，實(shí)驗(yàn)研究主要集中于評(píng)估與腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ拖嚓P(guān)的行為和認(rèn)知上的改變。迄今為止，還沒(méi)有一種單一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)被普遍承認(rèn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究都采用多種不同的評(píng)價(jià)方法對(duì)缺血效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)是一門(mén)不斷發(fā)展的科學(xué)，現(xiàn)有的測(cè)試也正在不斷的改進(jìn)中。上述各項(xiàng)神經(jīng)功能評(píng)分均不同程度地反映了小鼠腦缺血后感覺(jué)功能、運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙及后期恢復(fù)的程度，可作為造模是否成功的標(biāo)志。每項(xiàng)評(píng)價(jià)都具有優(yōu)缺點(diǎn)和側(cè)重點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇或搭配使用，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和結(jié)果的可靠性與真實(shí)性。

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