動物源產氣莢膜梭菌耐藥性的研究進展＊

董衛超，劉 凌，杜向黨

產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）是一種能夠產生多種毒素并且具有芽孢形成能力的革蘭氏陽性厭氧桿菌。該菌為條件性致病菌，普遍存在于環境及哺乳動物和禽類的胃腸道中，在條件適宜的情況下能夠迅速繁殖并產生毒素。根據該菌所產毒素種類不同 （α、β、ε、ι），可分為 A、B、C、D和 E 5型。其中，A型產氣莢膜梭菌主要引起人類的氣性壞疽、胃腸道疾病（食物中毒、抗生素樣腹瀉）、嬰幼兒猝死綜合癥，以及動物腹瀉和禽類的壞死性腸炎等；B、C、D和E型產氣莢膜梭菌主要引起家畜的腸道疾病，同時C型產氣莢膜梭菌還能引起人類的壞死性腸炎［1－2］。多年以來，該菌一直是危害畜牧業發展和人類健康的重要病原菌之一。

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用，產氣莢膜梭菌的耐藥性日漸加重，尤其是臨床強毒株逐漸出現了多重耐藥的典型特點。此種狀況勢必加速了強毒株的進化適應性及快速擴散，引起對食品安全和人類健康的潛在威脅。動物梭菌病目前在我國獸醫臨床較為常見，而其耐藥性的流行病學資料及耐藥機制的研究數據還相對缺乏。因此，本文就動物源產氣莢膜梭菌的耐藥機制及耐藥基因擴散機理作以下綜述。

1 動物源產氣莢膜梭菌的耐藥機制

1．1 四環素類 動物源產氣莢膜梭菌對四環素類藥物的耐藥性較為常見，主要的耐藥基因包括tet（K）、tet（L）、tet（M）、tetA（P）和tetB（P）等［1］。其中，tet（M）基因編碼核糖體結合蛋白，該蛋白可促進結合于細菌30S亞基的四環素移位，縮短游離態四環素的半衰期，從而降低四環素的抑制作用，導致細菌耐藥［3］。tetB（P）編碼蛋白與 TetM－like蛋白高度同源［4］。而tet（K）、tet（L）和tetA（P）編碼蛋白的功能基本相似，均為四環素外排泵蛋白。

Rood等（1985）報道了豬源產氣莢膜梭菌對四環素、大環內酯類－林可胺類、氯霉素等藥物的耐藥狀況。結果還進一步證實，四環素耐藥基因位于可接合R－質粒上［5］。Gholamiandehkordi等（2009）在禽源產氣莢膜梭菌中檢測到tet（K）和tet（L）基因［6］。Slavic等（2010）對多種動物（牛、豬、雞等）源產氣莢膜梭菌四環素類、大環內酯類、林可胺類等抗菌藥物耐藥狀況進行了描述［7］。目前，已在雞、豬、犬、牛等多種動物源產氣莢膜梭菌檢測到tetA（P）、tetB（P）、tetB（M）基因［1，4］。

1．2 大環內酯類 動物源產氣莢膜梭菌對大環內酯類藥物耐藥的主要機制有作用靶位改變和主動外排。其中，erm基因主要通過23SrRNA甲基化使抗生素不能與其靶位結合而出現耐藥。該耐藥現象不僅局限于大環內酯類抗生素，同時也涉及林可胺類類和鏈陽霉素類，即對大環內酯類－林可胺類－鏈陽菌素類（macrolide－lincosamide－streptogramin B，MLSB）三類藥物同時耐藥［8］。mef（A）基因通過編碼外排泵介導對四環素耐藥［9］。

Berryman等（1994、1995）在豬和人源梭菌上檢測到ermBP和erm（Q）基 因［8，10］。此 外，Soge 等（2008）在環境產氣莢膜梭菌中檢測到erm（B）、erm（Q）和mef（A）基因［9］。提示這些耐藥基因已在動物、環境和人源產氣莢膜梭菌中廣泛存在。

1．3 林可胺類 產氣莢膜梭菌對林可霉素類藥物耐藥主要由lnu基因家族編碼的林可霉素核苷酸轉移酶介導，該酶可導致林可霉素的修飾或滅活。

Martel等（2004）已在比利時肉雞中發現lnu（A）或lnu（B）基 因［11］。Gholamiandehkordi 等（2009）在禽源產氣莢膜梭菌中檢測到lnu（A）和lnu（B）基因［6］。Lyras等（2009）在禽產氣莢膜梭菌中發現了lnu（P）基因［12］。

1．4 鏈陽霉素類 鏈陽霉素的作用機制與大環內酯類和林可胺類抗生素相似。因此，細菌對該三類藥物耐藥往往呈現一定的關聯。Berryman等（1994，1995）在動物和人體內檢測到erm（B）和erm（Q）基因的同時也發現，攜帶erm（B）和erm（Q）基因的產氣莢膜梭菌具有 MLSB耐藥表型［8，10］。

1．5 其他類

1．5．1 氯霉素 動物源產氣莢膜梭菌對氯霉素的主要耐藥機制由氯霉素乙酰轉移酶介導，該酶可導致氯霉素修飾或滅活。Rood等（1985，1989）報道了豬源產氣莢膜梭菌對氯霉素的耐藥狀況。雜交試驗證實，在這些菌中存在catP和catQ基因［5，13］。

1．5．2 桿菌肽鋅 桿菌肽鋅是在家禽養殖業廣泛應用的一個抗菌促生長劑。最近，我們在桿菌肽鋅耐藥禽A型產氣莢膜梭菌上鑒定了bcrABDR基因。這些基因編碼的BcrA、BcrB、BcrD和BcrR蛋白分別和腸球菌桿菌肽鋅耐藥蛋白存在一定的氨基酸同源性。其中，bcrA和bcrB為必需的外排泵功能基因，可導致桿菌肽鋅耐藥，而bcrR為調控基因［14］。

1．6．2 利奈唑胺 利奈唑胺是首個獲得批準的惡唑烷酮類抗菌藥物，對包括耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌 （meticillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐青霉素肺炎雙球菌（Penicillin－resistant pneumococci，PR－PnC）及耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin－resistant enterococci，VRE）在內的大多數革蘭氏陽性病原菌均具有強大的抗菌活性。但隨著該藥的廣泛應用，耐藥菌株也相繼出現。細菌對利奈唑胺的耐藥機制主要包括23SrRNA的單個核苷酸突變、cfr基因介導的對23SrRNA的甲基化以及50S核糖體亞基L4蛋白的氨基酸突變等。Holzel等（2010）在豬糞產氣莢膜梭菌中檢測到rplD基因的單一脫氧核苷酸的突變（C→T），該有義突變可引起相應的氨基酸突變（71G→D71），從而導致對利奈唑胺耐藥［2］。

2 動物源產氣莢膜梭菌耐藥基因的擴散機理

2．1 四環素類 Rood等（1985）發現，豬源產氣莢膜梭菌四環素耐藥基因位于可接合R－質粒上。通過對人和動物源產氣莢膜梭菌中接合型R質粒與pCW3接合型質粒的同源性進行比較，發現在產氣莢膜梭菌中檢測到的接合型R質粒均源自pCW3－like質粒［5，15］。Lyras等（1996）發現豬源產氣莢膜梭菌的接合型質粒pCW3攜帶tetA（P）、tetB（P）基因［4］。Park等（2010）發現tetB（P）基因可在雞源產氣莢膜梭菌中發生轉移［16］。

2．2 大環內酯類－林可胺類－鏈陽霉素類 Brefort等（1977）在豬源產氣莢膜梭菌發現，ermBP基因位于可誘動的非接合質粒上［17］。Berryman等（1995）通過試驗推測 產氣莢膜梭菌 基因可能源于腸球菌或者鏈球菌；同時推測erm（Q）基因可能位于接合性質粒上［10］。

Lyras等（2009）證實禽產氣莢膜梭菌lnu（P）基因位于轉坐因子tISCpe8上，而該轉座因子位于接合型質粒pJIR2774上，表明lnu（P）基因可以發生接合轉移［12］。

2．3 其他類

2．3．1 氯霉素 Abraham 等（1987）首次在產氣莢膜梭菌梭菌中檢測到攜帶氯霉素耐藥基因位于轉座子——Tn4451（pIP401）和Tn4452（pJIR27）上［18］；接著，Rood等（1989）又證實了豬源產氣莢膜梭菌catP位于接合性質粒pIP401上［13］。隨后，Lyras等（1998）的報道發現，catD基因的擴散與Tn4451和Tn4453密切關聯［19］。

2．3．2 桿菌肽鋅 最近，我們在鑒定桿菌肽鋅耐藥禽A型產氣莢膜梭菌bcrABDR基因的基礎上，進一步通過接合試驗，質粒雜交試驗和全基因組測序，證實了該基因位于約26kb的接合型轉座子上，該轉座子暫命名為Tn4455。該轉座子可攜帶桿菌肽鋅耐藥基因發生一定頻率的接合轉移（1．2×10－6～2．8×10－1）［14］。

3 結語與展望

目前，在動物源產氣莢膜梭菌中鑒定的耐藥基因主要有：四環素耐藥基因tet（M）、tetA（P）、tetB（P）、tet（K）和tet（L）；大環內酯類耐藥基因erm（B）、erm（Q）和mef（A）；林可胺類耐藥基因lnu（A）、lnu（B）和lnu（P）；鏈陽霉素耐藥基因erm（B）和erm（Q）；氯霉素耐藥基因catP、catQ和catD；桿菌肽鋅耐藥基因bcrABDR等。其中erm（B）和erm（Q）基因可引起對大環內酯類－林可胺類－鏈陽霉素類（MLSB）三類藥物的共同耐藥。

四環素耐藥接合型質粒pCW3是動物源產氣莢膜梭菌接合轉移的一個重要模式質粒［4－5，20］。其tcp（產氣莢膜梭菌接合轉移功能區，由11個基因組成）區被鑒定為該質粒發揮接合功能的核心功能區，在已鑒定的大多數產氣莢膜梭菌接合型質粒中均高度保守。而轉座子Tn4451、Tn4452、Tn4453和Tn4455等也在產氣莢膜梭菌耐藥相關基因轉移中發揮著至關重要的作用［14，18－19］。特定情況下，非接合型質粒也可在接合型質粒的誘動下發生水平轉移［8］。

隨著動物源產氣莢膜梭菌耐藥機制的研究深入，新的耐藥基因將會被不斷發掘，例如近年來在人醫和獸醫臨床革蘭氏陽性病原菌 金黃色葡萄球菌腸球菌等）中已出現的可導致對五類藥物（氯霉素類、林可胺類、惡唑烷酮類、截短側耳素類和鏈陽霉素A，PhLOPSA）共同耐藥的cfr基因是否在動物源產氣莢膜梭菌中存在目前還不清楚。在產氣莢膜梭菌多數接合型質粒中高度保守的tcp區是如何發揮接合功能的，還有待于全面的闡明［20］。隨著全基因組測序技術和功能基因組學的快速發展，新的轉座子以及接合型轉座子將會不斷發現，其在產氣莢膜梭菌耐藥基因及毒素基因的水平轉移中發揮的作用尚需進一步的深入認識［14］。

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，多藥耐藥產氣莢膜梭菌強毒株不斷出現，對動物及人類健康造成了極大威脅。有必要對該菌耐藥的發生及傳播機制進行深入研究，為臨床合理用藥和新藥研發提供理論依據。

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