腸出血性大腸桿菌粘附機理的研究進展＊

崔 強，周志江，劉建青，肖華志

EHEC是一群重要的傳染性病原菌，有若干血清型，其中以 O157∶H7血清型菌株為主［1］。EHEC O157的感染因具有暴發流行趨勢、較強的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已成為全球性公共衛生問題。2011年5月中旬，一場由EHEC細菌引發的疫情在德國北部集中暴發。由于廣譜β－內酰胺酶CTX－M等質粒基因的作用，這些細菌對第三代頭孢菌素等抗生素有耐受性［2］。據世界衛生組織統計，截至2011年6月24日，已報告3 043例EHEC O104∶H4感染病例，16例死亡，HUS病例877例，造成32例死亡。除德國外，美國、英國、瑞典、加拿大、新西蘭等15個國家也有上述病例報告［3］。

EHEC的主要致病因子有兩個，一是它產生毒力極強的志賀毒素，一是它具有粘附到上皮細胞的能力，粘附是該菌引起發病的重要環節。通常出血性大腸桿菌O157引起人或動物的感染必須粘附到腸粘膜上皮細胞，然后在此定居、釋放外毒素，從而引起疾病［4］。目前，關于EHEC的粘附機理比較公認的是緊密素起重要作用，但僅僅依靠緊密素仍不足以引起粘附，除緊密素外，還從EHEC中鑒定出許多其他粘附因子。本文將就各類粘附因子進行分類闡述，并總結其粘附機理及研究進展。

1 粘附因子

1．1 緊密素（Intimin） 緊密素是由eae基因編碼的94～97kDa的外膜蛋白，是腸道的粘附因子。緊密素既為AE損傷過程中所必需的，又介導細菌在腸黏膜上皮細胞刷狀緣上粘附定居，避免細菌被腸道黏膜分泌液及腸蠕動清除［5］。

緊密素由表現同源性的N端和表現多肽受體結合活性的C端組成。此粘附素有不同的抗原亞型，包括緊密素α，β，γ，δ和ε。緊密素α的C端280個氨基酸構建成3個球狀結構域，其中由β長帶夾心結構組成的前兩個結構域與免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin Super Family，IgSF）類似。結合緊密素受體的活性片段貫穿這個類IgSF結構域和鄰近的類凝集素結構域，而緊密素受體結合位點在類凝集素結構的頂端殘基上［6］。

緊密素不僅能與緊密素受體相互作用，也可以與宿主受體結合。緊密素的不同抗原亞型能夠決定細菌在宿主體內的不同組織嗜性，而對特定位點的突變研究已經發現了決定組織嗜性的關鍵殘基［7］。

1．1．1 AE損傷（Attaching／Effacing lesion） 緊密素是通過AE損傷過程發揮粘附作用的。AE損傷是指細菌能夠附著在腸上皮細胞表面的微絨毛上，并將腸上皮微絨毛抹平，使細菌粘附處正下方的細胞骨架結構發生重排，同時發生絲狀肌動蛋白的聚集。細菌在粘附過程中依附在細胞表面的基座結構上，此結構能延伸到細胞外10μm處［8］（圖1）。

圖1 AE損傷（透射電鏡圖像）［8］B：附著的大腸桿菌菌體；P：宿主細胞底座結構；M：宿主細胞微絨毛Fig．1 AE lesion（TEM images）B：Adhesive E．coli；P：The base structure of host cells；M：Microvilli of host cells．

1．1．2 Tir（Translocation intimin receptor） AE損傷的形成需要一種叫Tir的蛋白，其由Ⅲ型分泌系統分泌后借助EspA、EspB、EspD轉位于宿主細胞，表現為緊密素受體功能。緊密素與Tir結合后可引起宿主細胞信號轉導反應并導致細胞骨架重排而形成特異性損害。Tir與緊密素的兩個跨膜結構域一起在宿主細胞質形成一個發卡拓撲結構［9］。

1．2 LEE編碼蛋白和非LEE編碼蛋白 EHEC的染色體上有一個43kb的腸細胞脫落毒力島（Locus of enterocyte effacement，LEE）。LEE不僅編碼轉運蛋白EspA，EspB和EspD，還編碼效應蛋白EspF，EspG，EspH，EspZ，Tir和 Map。某些非LEE編碼蛋白（non－LEE－encoded，Nle），包括周期抑制蛋白（Cycle inhibiting factor，Cif）、Tccp（Tircytoskeleton coupling protein）、EspJ 和 NleA、NleC、NleD，同樣由Ⅲ型分泌系統分泌。

1．2．1 EspA／B／D 作為轉運蛋白，EspA 形成Ⅲ型分泌系統的延伸絲狀結構。此絲狀結構負責將細菌分泌的包括Tir在內的效應蛋白轉運到宿主細胞內［10］。EspB和EspD在此轉運過程中同樣不可或缺，他們在宿主細胞膜上形成孔，與EspA結合，成為EspA絲狀結構的末梢［11］。

1．2．2 EspF／G／H，Map EspF 與 Map共同作用，破壞跨膜阻抗并協助線粒體膜電位的形成，誘導細胞凋亡。其中 Map還可以形成絲足［12］。而EspG與EspH共同作用于對宿主細胞骨架的控制和破壞。其中有研究表明EspG能降低細菌粘附能力［13］。

1．2．3 Tccp 在大腸桿菌O157∶H7形成的AE損傷中，宿主細胞骨架成分（F－肌動蛋白和α－肌動蛋白）的補充依靠另外一種被轉入宿主細胞的效應蛋白—Tir細胞骨架偶聯蛋白（TccP）［14］。在體外人類HeLa細胞實驗中，tccp的突變表達產物盡管粘附得很好，卻無法聚集纖維型肌動蛋白。然而在牛的體內實驗中，tccp的突變表達產物可以與典型的基座結構結合導致AE損傷。這說明基座結構的形成在體內和體外有不同，可能的原因包括宿主細胞的差異和效應因子在體內環境中所起的作用［15］。

1．2．4 EspJ EspJ能阻止巨噬細胞的吞噬作用，并不參與AE損傷過程［16］。Dahan等人的動物實驗表明EspJ能通過阻止宿主的免疫應答來提高定植能力，但是有限的可用證據亦表明EspJ或許能降低細菌存活率［17］。

1．2．5 Cif Cif蛋白由λ形噬菌體編碼，許多EHEC和EPEC菌株攜帶功能性Cif或Cif的變異體。它可在HeLa細胞中觸發一個不可逆轉的病變效應，表現為局灶性粘附的逐步聚集，應力纖維的裝配，以及對細胞周期的抑制作用［18］。有學者提出Cif能在短時間對大量細胞的細胞周期產生抑制作用，比如對腸上皮細胞，這很可能會輔助細菌定居和存活繁殖［19］，不過相關研究尚未得到發表。

1．2．6 NleA，NleC，NleD NleA／EspI蛋白由大腸桿菌O157∶H7基因組的噬菌體CP933P編碼，集中在宿主細胞高爾基體內，干擾其分泌機制［20－21］。Marche｀s等 人 發 現 了 NleC 蛋 白 和 NleD蛋白，并將野生型大腸桿菌O157∶H7菌株及nleC，nleD的等基因突變表達產物分開口服于羊體內，在隨后7d里，羊群所排泄的糞便中菌體的密度基本一樣，可得出結論：NleC和NleD對大腸桿菌O157∶H7在羊體內的粘附和定居都并非必需的［22］。

1．3 菌毛 菌毛是細菌的一種蛋白性突起，對宿主上皮細胞有粘附作用。這對細菌對宿主的入侵、定居從而打開侵襲的通道起著至關重要的作用。研究已經發現在大腸桿菌O157∶H7中至少有16個菌毛基因簇的表型［23］。Roe等學者發現，由于受到其調控子‘fim開關’中一段大小為16bp的DNA缺失的影響，EHEC O157∶H7無法表達Ⅰ型菌毛［24］。

長極菌毛（Long polar fimbriae，LPF）在大腸桿菌O157∶H7的粘附過程中成為潛在的決定因素。大腸桿菌O157∶H7中有兩個lpf基因，他們雖與鼠傷寒沙門氏菌中的lpf位點同源，但并不完全相同［25］。其中任意一個lpf基因位點的突變都能改變大腸桿菌O157∶H7在人體腸道中的粘附嗜性，即粘附范圍反常地從回腸小囊上皮細胞（野生型粘附嗜性）擴大到其他小的腸上皮細胞區域［26］。

在特定的培養條件下，Ⅳ型菌毛和‘F9’菌毛可以從大腸桿菌O157∶H7中提取出來。Ⅳ型菌毛可以協助大腸桿菌O157∶H7粘附到人、牛體內和豬內臟中，但是現在還缺乏體內實驗驗證［27］。在牛體內對其突變體的研究尚未確認‘F9’菌毛在細菌粘附中的作用［28］。發酵山梨醇的EHEC O157∶H菌株能表達只在厭氧條件下才由質粒編碼的菌毛，它能提高細菌對人體腸道上皮細胞的粘附能力［29］。

引發2011年德國大規模疫情的菌株被認為是EHEC，卻能夠表達腸道聚集粘附性大腸桿菌（EAEC）的聚集粘附型菌毛［30］。有學者利用高通量測序技術對菌株的全基因組進行測序，發現此現象是大腸桿菌基因組可塑能力的表現，它得到了不同的大腸桿菌致病型（EAEC，EHEC和ExPEC）的基因［31］。經研究，這些基因是通過大腸桿菌水平基因轉移和同源性重組擴展到各個血清型的［32］。

1．4 脂多糖和外膜蛋白A 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在粘附中具有一些間接的作用。Paton等研究發現LPS的抗體封閉了O157粘附到Henle407細胞，但用LPS的抗體對Henle407細胞進行預處理并不能封閉細菌的粘附，所以推測LPS耐受抗性的粘附是通過位阻機理實現的［33］。而另一些體外研究發現LPS缺失突變株能高度粘附HEp－2細胞，暗示LPS可能遮蓋了細菌表面的粘附結構，或者LPS的缺乏導致了細胞的理化特性如表面的電荷或疏水性發生改變。

外膜蛋白OmpA（Outer membrane protein A）廣泛的存在于原核生物的細胞外膜中，具有β－桶狀結構。Torres等學者通過體外實驗證實OmpA作為外膜孔蛋白在EHEC O157∶H7粘附Hela細胞和Caco－2細胞的過程中起重要作用，但是在體內是否有同樣的作用不得而知［34］。

2 結 語

EHEC的粘附是一個復雜的過程，其精確的粘附機理還不太不清楚。隨著對細菌和宿主相互關系研究的深入，將來可能還會有新的粘附因子被發現。最新的研究多集中于NleC、NleE、EspP等新近發現而其粘附機理不甚明了的粘附蛋白以及HCP等參與菌毛粘附的粘附素。各粘附因子的作用和研究狀況的總結如表1所示。研究EHEC的粘附機理有3個重要意義：EHEC致病機理的理論得到進一步完善，更有利于預防和控制該菌引起的疾病；對細菌的血清型鑒定和診斷有重要意義；為EHEC疫苗的開發提供新思路，有助于我們研制用于預防的疫苗。

表1 EHEC粘附因子總結Tab．1 Summary of EHEC adhesion factors

續表

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