淡色庫蚊kdr等位基因突變及抗藥性檢測方法的研究＊

劉宏美，代玉華，王海防，程 鵬，黃曉丹，劉麗娟，趙玉強，王懷位，公茂慶

淡色庫蚊（Culexpipienspallens）是北方地區班氏絲蟲和乙型腦炎的主要傳播媒介，影響著人們的身體健康［1］?；瘜W防治是殺滅蚊蟲最重要的方法，尤以高效的擬除蟲菊酯類殺蟲劑為主。然而，該類殺蟲劑連續過度的使用引起了蚊蟲抗藥性的迅猛發展，藥效急劇下降。研究表明擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性產生與蚊蟲的神經軸突鈉離子通道（sodiumchannel，SC）第Ⅱ結構域S6節段1014位點的點突變密切相關，其引起的抗性表型稱之為靶標抗性（targetsiteresistance）又稱擊倒抗性（knockdown resistance，kdr）［2］。學者們首先在岡比亞按蚊（A－nophelesgambiae）和 致 倦 庫 蚊，（Culexpipiens quinquefasciatus）發現了 L1014F型突變［3］，后在阿拉伯按蚊（Anophelesarabiensis）幼蟲中發現L1014S型突變［4］，該位點上的堿基“T”突變為“C”，相應的亮氨酸被絲氨酸取代。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣本 淡色庫蚊自然種群試驗蚊蟲采自山東省濟南、濟寧和青島的監測點。敏感種群來在山東省疾病預防控制中心。采用羽化后1～3d的雌蚊做WHO成蚊接觸筒法生物活性測定。

1．2 試劑 溴氰菊酯（99．0%），購自德國 Dr．Ehrenstorfer公司，總DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購自QIAGEN公司，蛋白酶抑制劑、Pyrobest DNA Polymerase、dNTP、RNA 酶、DNA 分子量標準2000均購自Takara公司，引物由AUGCT公司合成，白油，購自美國Sigma公司。

1．2 方 法

1．2．1 WHO成蚊接觸筒法 采用 WHO標準藥膜（將白油和乙醚按1∶2的體積配比的混合物與溴氰菊酯混合，吸取3mL滴于16×12．5cm的新華Ⅰ號濾紙上，其溴氰菊酯濃度為0．05%）。以WHO區分劑量標準進行測定，同時設空白對照，記錄接觸10、15、20、30、40、50、60min時蚊蟲的擊倒數量。將接觸藥膜60min后的受試蚊吹入恢復筒，以10%的葡萄糖水飼養24h，記錄成蚊的死亡數和存活數，收集－70℃保存，用于提取DNA。

1．2．2 成蚊基因組DNA提取 選取濟南、青島、濟寧及敏感種群的受試紋，分為敏感組（死亡）和抗性組（存活）淡色庫蚊，共418只。用QIAGEN公司的DNeasy Blood﹠Tissue Kit試劑盒按其步驟提取單蚊基因組DNA。

1．2．3kdr基因擴增 以淡色庫蚊鈉離子通道cDNA為模板，應用Primer primier 5．0軟件，設計特異性引物為 C1 5′－CCTGCCACGGTGGAACTTC－3′，C2 5′－GGACAAAAGCAAGGCTAAGAA－3′。反應體系為50μL，含有10×Pyrobest Buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase，0．25μL；dNTP，4 μL；基因組 DNA、C1、C2各1μL；ddH2O，37．75 μL。94℃，5min；94℃，40s，55℃，50s，72℃，

1min，32個循環；72℃，8min；4℃保存。將PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1．2．4 DNA片段純化 按照試劑盒說明進行純化。將DNA回收溶液送北京諾賽公司測序。

1．2．5kdr基因AS－PCR擴增 以淡色庫蚊基因組DNA為模板，設計5種引物（C1，C2，C3，C4，C5）對此進行擴增。引物序列為C1、C2，C3 5′CCACCGTAGTGATAGGAAATTTA 3′，C45′ACGCTGG AATACTCACG ACTG 3′，C5 5′ACGCTGGAA TACTCACGACA 3′。反應體系含有10×Pyrobest Buffer，5μL；dNTP，4μL；基因組DNA，2 μL；C1，0．5μL；C2，0．5μL；C3，1μL；Pyrobest DNA Polymerase，0．25μL；ddH2O，35．75μL；a管中加入C4，1μL；b管中加入C4，1μL，共50μL。94℃，5min；94℃，1min，55℃，2min，72℃，2 min，40個循環；72℃，10min；4℃保存。將PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

2 結 果

2．1 WHO成蚊接觸筒法 WHO抗藥性評價指標死亡率98%～100%為敏感群體（S）死亡率80%～97%為初步抗性群體（M）死亡率80%～以下為抗性群體（R）。

2．2 單蚊基因組DNA提取 將濟南、濟寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫蚊分為敏感組（死亡）和抗性組（存活），共418只，提取單蚊基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳中在相應的位置跑出條帶，見圖1。

2．3kdr基因擴增、測序 以上述濟南、濟寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫蚊單蚊基因組DNA為模板，以C1、C2為引物進行PCR，擴增kdr基因片段，得到與預期大小（521bp）一致的基因片段，見圖2。

測序結果見圖3，不同地區淡色庫蚊成蟲6種kdr基因型、等位基因頻率與抗藥性表型的關系如下表2。

2．4kdr基因AS－PCR擴增 見圖3。

濟南、濟寧、青島和敏感的4個種群Kdr基因L1014F等位基因頻率分別為42．92%、61．27%、29．52%、18．09%，濟南、濟寧、青島和敏感的4個種群成蚊接觸筒的存活率分別為60．38%、62．75%、16．19%、1．90%，以Kdr基因L1014F等位基因頻率為x，以成蚊接觸筒的存活率為y，建立回歸方程為y＝1．536935x－23．0217，R2＝0．853049，P＜0．05。

濟南，濟寧，青島和敏感的4個種群Kdr基因L1014S因頻率分別為19.81%、21.57%、5.24%、0%，濟南、濟寧、青島和敏感的4個群成蚊接觸筒的存活率分別為60.38%、62.75%、16.19%、1.90%，以Kdr基因L1014S等部位頻率為x，以成蚊接觸筒的存活率為y，建立回歸方程為y＝2．892202x＋1．596388，R2＝0．998554，P＜0．05。

表1 不同地區淡色庫蚊成蟲對溴氰菊酯的抗藥性Tab．1 The bioassay result of deltamethrin resistance in Culex pipiens pallens

表2 不同地區淡色庫蚊成蟲6種kdr基因型、等位基因頻率與抗藥性表型的關系表（基因測序）Tab．2 kdr genotype and allele frequency in relationship to phenotypes determined by the deltamethrin resistance bioassay in Culex pipiens pallens populations in different regions

用基因測序的方法檢測淡色庫蚊Kdr基因發現，L1014F等位基因頻率和L1014S等位基因頻率與抗性水平呈正相關

2．5 2種檢測方法分析 我們選擇從濟寧采集的淡色庫蚊進行AS－PCR的檢驗。其中C1、C2是外引物，擴增521bp的等位基因片段，C3和C4、C5是特異性內引物，用以擴增389bp（等位基因TTA）的等位基因和176bp（等位基因TTT和TCA）的等位基因。經過3次重復實驗，在102份樣品中，我們獲得了64（62．75%）份樣品的結果。將 RT－PCR和AS－PCR 的 結 果 進 行 卡 方 檢 驗，結 果：χ2＝11．830850，P＝0．000583，P＜0．05，RT－PCR的陽性檢出率高于AS－PCR，因此RT－PCR這種檢測方法更有效。

3 討 論

蚊蟲的對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的擊倒抗性（knockdownresistance，kdr）又稱為靶標抗性（targetsiteresistance），是由于神經細胞膜para型鈉離子通道靶標位點的點突變造成的［5］。在科特迪瓦地區6個岡比亞按蚊自然種群中發現了鈉通道ⅡS6節段1014位點的L1014F型突變，即堿基“A”突變為“T”；在喀麥隆地區的岡比亞按蚊的研究中也證實kdr基因L1014F突變與抗溴氰菊酯表型呈正相關［2］。chen等［6］對南京等地的淡色庫蚊的para型鈉離子通道進行測序，也發現了L1014F型突變，并與擬除蟲菊酯抗藥性表型密切相關，與本文得出的結論一致。但在Abdalla等［7］對蘇丹地區的14只自然種群的阿拉伯按蚊的研究中未發現kdr基因L1014F突變與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性表型有相關性。然而研究人員認為［8］，該研究的樣本量不足50只，所以樣本量過少，不足以體現基因突變與抗藥性表型間的關系。本實驗所研究的濟南、濟寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫蚊樣本量分別為64、51、74、105只，保證了實驗的準確性。

Kawada等［4］在岡比亞按蚊幼蟲和阿拉伯按蚊幼蟲發現了L1014S型突變，Om P Singh等［9］對阿爾瓦地區的斯式按蚊進行研究，首次在斯式按蚊中驗證了該型突變。在對RSP－ST抗性品系的岡比亞按蚊研究中發現kdr基因突變型L1014S／L1014S（RR）純合子在氯氰菊酯抗藥性組群中的比例明顯增高，被認為與氯氰菊酯抗性表型正相關［10］。很多報道證實了L1014S的突變的發生于其抗藥性相關。這與本實驗結果即kdr基因L1014S突變與溴氰菊酯抗藥性表型呈高相關性（R2＝0．998554）一致。然而在Chen等［6］的研究中認為淡色庫蚊L1014S突變與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性無明顯相關性，可能與她的研究中L1014S／L1014S（RR）純合子總個數為1，使L1014S突變所引起的抗藥性被忽略有關。本實驗檢測出的L1014S／L1014S（RR）純合子總個數為8，含有L1014S等位基因的蚊蟲個數為14，確保了實驗有更高的可信性。

在AS－PCR檢測方法使用2個平行的PCR反應體系鑒定同某1個體基因型，只在389bp處出現條帶，則該樣本為野生純合基因型TTA／TTA（SS）；如是突變純合子（RR）則只在176bp處只出現一條帶，若出現兩條帶為雜合子（RS），可直觀的看出每個樣品的基因型。這種技術簡單，經濟，省去了純化、測序、序列對比等步驟，廣泛應用于各種蚊蟲的抗藥性研究的大規?，F場檢測中，比如中華按蚊、岡比亞按蚊等。但是AS－PCR方法常發生非特異性延伸或者引物二聚體條帶，影響了研究的陽性檢測率和準確性，因此，在進行kdr等位基因頻率與不同自然種群抗藥性水平的研究中，RT－PCR優于AS－PCR。

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