牦牛酥油支鏈脂肪酸對人乳腺癌細胞抑制的轉錄組學分析

袁錦瑩，孫萬成，羅毅皓,*，丁建霞

（1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.青海省剛察縣哈爾蓋畜牧獸醫站，青海 剛察 812300）

牦牛酥油是中國青藏高原地區牧民攝入脂肪的主要膳食途徑之一，特殊的高原氣候賦予了牦牛乳高于普通牛乳的營養價值[1]。生活在海拔3 000～5 000 m的藏族人民普遍身體健壯，這與經常攝食牦牛酥油有關[2]。牦牛酥油能為人體提供充足的能量，并且具有保健功能[3]，而其保健功能部分來源于功能性脂肪酸。牦牛酥油中脂肪酸的組成較普通奶油存在較大的差異，酥油中的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸含量均高于普通奶油[4]。因此，牦牛酥油中的不飽和脂肪酸及支鏈脂肪酸（branched-chain fatty acids，BCFA）的功能特性具有較大研究價值。

目前，國內外均有許多關于尿素絡合法分離純化油脂的報道。Mudgal等采用尿素絡合法對奶油中的BCFA進行了研究[5]。但是鮮有關于尿素絡合純化牦牛酥油脂肪酸的研究。經皂化制取牦牛酥油的游離脂肪酸，再用尿素絡合所得的混合脂肪酸，可以純化牦牛酥油中的BCFA。

近幾年來，ω-3多不飽和脂肪酸能夠有效抑制癌細胞生長已得到越來越多的證實。研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸在體內代謝過程中可引起輕度的氧化應激，由此產生的脂質過氧化產物能破壞腫瘤細胞膜，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制惡性腫瘤細胞的生長[6]。但是有關BCFA對惡性腫瘤影響的報道比較少，國外對牦牛酥油中BCFA的功能也鮮有研究。

植物中BCFA含量很低，其主要存在于動物的液體乳與組織中，特別是在嬰兒的胎脂中含量很高。人乳中BCFA質量分數大約為1.5%，牛乳中約為2.0%[7-9]。Yang Zhenhua等[10]發現從大豆中發酵純化的13-甲基肉豆蔻酸可以作為一種抗腫瘤化合物和選擇性誘導人類癌癥細胞凋亡的生長抑制劑，并觀察到BCFA能抑制乳腺癌細胞脂肪酸的合成。細胞生長的調節能使刺激信號與抑制信號之間達到穩態平衡，誘導細胞凋亡引起的負生長調控得到研究者的廣泛關注，其為惡性腫瘤的治療提供了一種新的策略[11-16]。復雜的信號轉導系統參與誘導細胞凋亡[17-18]，因此，有必要研究BCFA誘導細胞凋亡的機制。最近的研究結果表明，50%的BCFA存在于細胞膜上，能顯著降低細胞膜的熔點，并提高其流動性；同時，BCFA具有一定的抑制癌細胞生長的作用[19-20]。

目前，轉錄組學被廣泛應用于癌癥、心血管疾病等多種疾病的研究中。其能夠利用生物信息學方法從基因表達水平、生物過程富集通路、蛋白-蛋白互相作用、轉錄因子等方面系統分析疾病基因表達與正常基因表達之間以及不同疾病基因表達之間的差異性[21]。有必要通過有效的數據挖掘手段從轉錄組學水平上分析乳腺癌的分子機制[22]。

本實驗從轉錄組學角度分析牦牛酥油中的BCFA對人乳腺癌細胞的抑制作用，并進行生物學驗證。探討與癌癥、脂肪酸以及細胞凋亡相關的差異表達基因的表達情況。旨在明確牦牛酥油中的BCFA抗乳腺癌的作用機制，為乳腺癌治療提供理論和科學依據。這不僅有利于在畜牧生產中采用合理的營養調控措施以提高畜產品品質，而且對預防和治療乳腺癌等疾病具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細胞株（SK-BR-3）購自上海博古生物科技有限公司。實驗所用酥油購自青海省祁連縣牧民家，牦牛酥油經尿素絡合純化后獲得質量分數為16.3%的BCFA，原酥油中所含BCFA質量分數為3.3%。

粉末培養基、胎牛血清 澳大利亞Gibco公司；質量分數0.25%胰蛋白酶細胞消化液 美國Hyclone公司；0.22 μm濾芯 美國密理博公司；Blood DNA Kits（D3492-01） 美國Omega Bio-tek公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）細胞增殖試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DMI4000B倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；CO2培養箱、低溫離心機 上海滬粵明科學儀器有限公司；BG-Power 300電泳儀 貝基恩生物科技有限公司；WD-9413A凝膠成像分析儀 北京市六一儀器廠；CytoFLEX流式細胞儀 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；2100生物分析儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛酥油脂肪酸的純化

以牦牛酥油經皂化、酸化后獲得的游離脂肪酸為空白組（Butter組）。將經尿素絡合純化的牦牛酥油中的BCFA作為實驗組（BCFA組），BCFA與游離脂肪酸分別溶于無水乙醇中（質量濃度300 mg/L），－80 ℃保存備用。所有實驗做2 個平行。

1.3.2 細胞培養

待人乳腺癌細胞株長滿（80%～90%）后進行傳代。將培養基用0.22 μm濾膜過濾，按照體積比1∶2～1∶3加入質量分數15%胎牛血清與1%雙抗。

1.3.3 BCFA作用于人乳腺癌細胞

挑出人乳腺癌細胞生長較滿的培養瓶進行實驗。向長滿細胞的培養瓶中加入游離脂肪酸作為空白組，加入BCFA作為實驗組。放入培養箱37 ℃、5% CO2培養24 h后在倒置顯微鏡下觀察其形態變化。

1.3.4 提取總RNA

使用Blood DNA Kits（D3492-01）分別從加入BCFA與游離脂肪酸的癌細胞中提取總RNA，檢測RNA純度與濃度，按試劑盒說明書進行操作。用質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳及2100生物分析儀檢測其完整性。

1.3.5 轉錄組測定

測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。原始序列中需要去除低質量的reads，得到clean-reads數據作為后續信息分析的基礎。使用Cluster Prof i ler軟件進行聚類分析，利用GO數據庫對差異表達基因進行功能注釋。

1.3.6 MTT檢測

將細胞在顯微鏡下計數并調整細胞濃度至5 000 個/孔，接種于96 孔培養板中，每孔0.2 mL，在培養箱中孵育24 h后貼壁培養。分別取1、2、4 μL稀釋10 倍體積后的BCFA溶液加入乳腺癌細胞中，BCFA終質量濃度分別為75、150、300 mg/L，以4 μL終質量濃度300 mg/L的游離脂肪酸溶液作為對照，每組做4 個重復。將96 孔培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT試劑，輕輕混合，于37 ℃培養箱內繼續孵育4 h。從每個孔中吸取培養基，加入100 μL MTT溶解劑，混合10 min后在顯微鏡下觀察紫色結晶狀沉積物是否全部溶解，待沉積物溶解后，使用酶標儀在波長570 nm處測定OD值，OD值越高表明細胞活性越強[23]。

1.3.7 流式細胞計數分析

分別取5、10、20 μL BCFA-乙醇溶液加入乳腺癌細胞培養瓶（10 mL）中，終質量濃度分別是75、150、300 mg/L，并取自然生長的乳腺癌細胞（10 mL）作為空白對照組，置于培養箱24 h后用冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞兩次，重懸細胞，將100 μL細胞懸浮液轉移到5 mL試管中，加入5 μL pacif i c BlueTMAnnexin V和10 μL碘化丙啶溶液，輕輕漩渦振蕩細胞，在室溫（25 ℃）下避光孵育15 min，每管加入400 μL膜聯蛋白V結合緩沖液[24]。用流式細胞儀分析，數據通過CytExpert軟件分析。

1.3.8 DAPI細胞形態觀察

用PBS洗滌實驗組（BCFA質量濃度為300 mg/L）和對照組（游離脂肪酸質量濃度為300 mg/L）細胞后離心收集，每組吸取50 μL細胞滴入載玻片，稍稍晾干后滴加50 μL DAPI染色液，室溫避光放置30 min后在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4 數據統計與分析

差異顯著性采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著；利用Excel 2016軟件進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 有效序列統計結果

將提取的RNA進行Illumina測序，獲得大于500 Mb的原始數據（raw-reads），將raw-reads進行過濾，剔除低質量的數據，整合后的數據為clean-reads，每個樣本的raw-reads均達到3 480萬以上。原始數據過濾后的堿基數為clean-bases，錯誤率為0.03%，Q20、Q30分別為Phred值大于20、30的堿基占總堿基的比例，GC_pct為clean-reads中G、C占4 種堿基的比例。對raw-reads進行過濾，得到clean-reads的比例在96.04%～97.23%以上（表1）。

表1 有效序列統計結果Table1 Results of effective sequence statistics

2.2 樣品間基因表達水平數據可靠性和樣本選擇合理性分析

圖1 差異基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differential genes

基因火山圖能夠快速查看兩組樣品間表達的差異水平分布情況。橫坐標表示基因在不同樣本中表達量的倍數變化，絕對值越大表明基因表達量變化的倍數越大；縱坐標表示表達差異的顯著性水平，其值越大表明篩選的差異表達基因越可靠。如圖1所示，差異基因主要以下調表達為主，下調基因較上調基因數量多且差異更加顯著。

2.3 差異基因聚類分析

圖2 差異基因聚類分析Fig.2 Clustering analysis of differentially expressed genes

如圖2所示，通過層次聚類的原理，對篩選得到的10 757 個差異基因的表達量和表達模式進行分析，可看出差異明顯。根據聚類分析結果和基因間表達模式的深層聯系，將結果定義為4 個聚類群。可以發現空白組和BCFA組的2 個組內重復聚集到了一起，而2 個組間基因表達模式則出現分離，表明樣本重復性較好，且分組較合理。

以P值作為差異表達基因篩選的關鍵指標，共鑒定出6 416 個基因，其中包括2 633 個表達上調的差異基因，主要有ENSG00000284691（AC073111.5）與ENSG00000284543（LINC01226）等基因；3 783 個表達下調基因，包含ENSG00000001084（GCLC）、ENSG00000000457（SCYL3）等。進一步分析發現，轉錄組結果中的顯著差異基因含有一些與癌癥、脂肪酸以及細胞凋亡相關的基因，FOS、JUN、MYCL等13 種原癌基因被下調。師銳贊等[25]發現c-fos基因的敲除能夠延長乳腺癌移植瘤的存活時間，抑制乳腺癌細胞的增生和浸潤。同時，與脂肪酸合成相關的FADS3、ELOVL4、ELOVL5基因被上調，ELOVL1、FASN、FADS2等7 種基因被下調。脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，FADS）2是催化單不飽和脂肪酸向多不飽和脂肪酸轉變的限速酶，與癌癥的發生、發展密切相關[26-29]；王玲玲[30]報道，FADS2的高表達會導致腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和非錨定克隆形成能力增強。FADS2基因下調會抑制腫瘤細胞的形成和增殖。本研究中腫瘤蛋白TP53、BCL6B和BCL6 3 種基因表達量降低。Raman等[31]發現，大部分的乳腺癌p53基因mRNA表達水平很低；在尋找潛在的p53轉錄調節因子時，發現p53啟動子上有同源基因（homeotic genes，HOX）結合位點。研究發現HOXA5表達與p53轉錄密切相關，其可使p53表達缺失，從而抑制乳腺癌的發生。

2.4 GO系統功能富集差異分析

GO系統由3 個相對獨立的本體組成，包括細胞組分、生物學過程和分子功能，這3 個部分可以完整描述基因的所有生物功能。

圖3 GO富集差異分析下調基因柱狀圖Fig.3 GO enrichment analysis

2 327 個下調基因中，7 026 個與分子功能相關，17 672 個與生物進程相關，5 445 個與細胞成分相關。由圖3可見，與生物進程相關的表達差異有核苷單磷酸代謝過程、核糖核苷單磷酸代謝過程、嘌呤核苷單磷酸代謝過程、前體代謝物和能量的產生、細胞呼吸作用、ATP代謝過程。細胞成分的表達差異主要分布在線粒體內膜、線粒體基質、線粒體蛋白復合物以及核糖體中，與分子功能相關的表達差異主要與核糖體結構成分、輔酶的結合、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶活性、氫離子轉運體活性等相關。

圖4 GO富集差異分析下調基因散點圖Fig.4 Scattering plot of GO down-regulation and enrichment analysis

從GO富集差異分析下調基因結果中選取最顯著的30 個功能類別或者細胞定位（Term）繪制散點圖，如圖4所示，所有Term校正后的P值均接近0.00。在最顯著的30 個Term中，3 個富集差異分析結果的基因數接近150 個，12 個富集差異分析結果的基因數量小于50 個，15 個富集差異分析結果的基因數在100 個左右。差異基因數量接近150 個的Term主要注釋線粒體基質、線粒體內膜、前體代謝物和能量產生等方面；差異基因數量小于50 個的Term主要注釋NADH脫氫酶活性、氧化還原酶活性、NAD結合；基因數量在100 個左右的Term主要注釋細胞呼吸作用、核糖體、輔因子結合等方面。

根據轉錄組測序結果可以得出，加入較高純度牦牛酥油BCFA的乳腺癌細胞與空白組相比相關基因表達有顯著差異。在GO富集差異分析結果中，控制細胞正常生長的必需生理過程、核苷單磷酸及核糖核苷單磷酸代謝過程、細胞呼吸以及ATP代謝過程、部分構成細胞的線粒體及核糖體合成的相關基因以及控制分子功能中NADH脫氫酶等酶活性基因被下調。而細胞的自我吞噬作用、蛋白酶自我分解過程以及蛋白酶介導的泛素依賴分解過程的相關基因被上調。

GO功能分析表明，RNA轉錄調節是基因的差異性表達調節生物功能的一種途徑，轉錄因子是轉錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子，是參與真核生物細胞轉錄調控的反式作用因子，在生物的生長發育過程中起重要作用。同時，參與線粒體和細胞核糖體合成的一些基因也被下調，導致分子功能中NADH脫氫酶的活性基因下調。因此，癌細胞的正常生長受到BCFA的抑制。

2.5 MTT檢測結果

圖5 不同質量濃度BCFA對乳腺癌細胞活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of BCFA on the viability of breast cancer cells

如圖5所示，加入150 mg/L BCFA時的細胞活性達到最低，且所有質量濃度BCFA組細胞活性均低于對照組。說明BCFA對乳腺癌細胞的細胞毒性強于游離脂肪酸，且能夠抑制乳腺癌細胞的增殖。

2.6 流式細胞計數分析

圖6 不同質量濃度BCFA對乳腺癌細胞活性影響的流式細胞計數分析Fig.6 Flow cytometric analysis of breast cancer cells treated with BCFA at different concentrations

如圖6所示，300 mg/L BCFA組的死細胞比例最高，細胞數量明顯少于其他實驗組，這是因為300 mg/L BCFA組的細胞毒性太強，使大量細胞死亡從培養瓶壁上脫落，用PBS沖洗后已所剩無幾。而其他實驗組雖然毒性也比較強，細胞大半失活，但沒有從培養瓶壁上脫落。因此，BCFA的質量濃度越高對癌細胞的抑制作用越強；BCFA能夠有效抑制癌細胞生長。

2.7 DAPI細胞形態觀察

圖7 DAPI染色后的細胞形態Fig.7 Cell morphology after DAPI staining of treatment and control groups

如圖7所示，實驗組細胞膜內可見多個圓形的小顆粒，是凋亡細胞的細胞核小體，說明BCFA能誘導乳腺癌細胞凋亡。

3 結 論

與對照組相比，加入較高純度牦牛酥油BCFA的乳腺癌細胞基因表達有顯著差異，轉錄組學分析篩選出與脂肪酸、癌癥及細胞凋亡相關的差異表達基因，發現FOS、FADS2、TP53等基因的下調在乳腺癌細胞的生長和凋亡中可能發揮了重要作用。GO富集差異分析結果也顯示實驗組細胞正常生長的必需相關基因被下調，細胞自我吞噬基因被上調，從而促使細胞凋亡。MTT實驗、流式細胞計數分析及DAPI細胞凋亡形態觀察也證實了牦牛酥油BCFA對乳腺癌細胞的細胞毒性作用。通過轉錄組學和細胞形態生物學共同驗證，可以初步推斷牦牛酥油BCFA對人乳腺癌細胞株的生長有明顯抑制作用，其作用機制復雜，受多種基因調控，需要進一步驗證其作用機理。本研究為牦牛酥油的進一步開發利用提供數據支持。