重組結核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白對不同分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應研究

蒲江 陶立峰 鄧海清 王德海

據WHO統計，2010年，全球約有140萬人死于肺結核，880萬罹患結核病，結核病已成為當今世界第二大傳染性疾病［1－2］。我國是全球22個結核病流行最嚴重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病流行最嚴重的國家之一。據2010年全國第五次結核病流行病學調查的數據，全國15歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬［3］，因此早期發現和診斷出高危人群，有效控制傳染源，是結核病疫情控制的關鍵。

近幾年，對早期分泌性抗原性靶蛋白（ESAT6）和早期培養濾液蛋白10（CFP10）抗原作為結核診斷的皮試試劑的研究較多，顯示出很好的安全性及較好的診斷特異度和敏感度［4－11］。本研究以重組結核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白作為抗原，對不同分枝桿菌菌種致敏的豚鼠進行皮試反應研究。

材料和方法

一、材料

1.動物：選取90只健康并未做過任何試驗的SPF級（無特定病原體級）白色雌性豚鼠（Hartley品系），體質量300～400 g（一般體質量滿足即可采用），周齡為15～20周。由中國食品藥品檢定研究院實驗動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2009－0017。

2.菌種：常見環境分枝桿菌組包括鳥分枝桿菌（CMCCB 95001）、胞內分枝桿菌（CMCCB 95002）、蟾蜍分枝桿菌（CMCCB 95003）、堪薩斯分枝桿菌（CMCCB 95013）、海分枝桿菌（CMCCB 95014）、瘰癘分枝桿菌（CMCCB 95017）、戈登分枝桿菌（CMCCB 95018）、蘇加分枝桿菌（CMCCB 95019）、龜分枝桿菌膿腫亞種（CMCCB 95021）（簡稱“龜膿分枝桿菌”）、偶發分枝桿菌（CMCCB 95022）、草分枝桿菌（CMCCB 95024）、微黃分枝桿菌（CMCCB 95030）；臨床常見致病分枝桿菌組包括非洲分枝桿菌（CMCCB 95049）、牛分枝桿菌（CMCCB 95055）、結核分枝桿菌（CMCCB 95052，CMCCB 93020，CMCCB 93009）；菌株由中國醫學細菌保藏管理中心提供。卡介菌（疫苗株）由中國食品藥品檢定研究院提供。

3.主要試劑：結核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin，TB－PPD），50 IU/ml，批號為20101105，液體制劑，由中國食品藥品檢定研究院提供；胞內分枝桿菌純蛋白衍生物（PPD of Mycobacterium intracellulare，PPD－B），0.4 mg/支，由中國食品藥品檢定研究院提供；重組結核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白，每支250μg/0.5 ml，液體制劑，批號為 M20101202，由安徽龍科馬生物制藥有限責任公司提供。

二、方法

1.菌液制備：取卡介菌凍干菌種（60 mg/支），以1 ml生理鹽水溶解后制成濃度為60 mg/ml的菌液。將其余15種新鮮培養的分枝桿菌配制成10 mg/ml菌液（活菌含量約為1×108CFU/ml），臨用前再以生理鹽水進行10倍稀釋。

2.動物篩選（皮試）：將豚鼠左背側局部去毛，皮內注射0.2 ml TB－PPD，于注射后24、48 h觀察局部硬結的縱徑與橫徑，根據48 h的反應結果進行判定，平均硬結反應直徑（縱徑與橫徑相加除以2）小于5 mm判為陰性［12］。90只豚鼠全部皮試陰性，留做實驗。共分為18組實驗，每組使用5只豚鼠。

3.致敏動物：于豚鼠腹股溝皮下注射制備的菌液［13］，每種菌液致敏5只豚鼠（皮試48 h后，如果皮試陰性，即可開始致敏）。卡介菌（疫苗株）活菌致敏組豚鼠和結核分枝桿菌死菌致敏組豚鼠各注射0.2 ml/只，飼養于清潔級動物房；其他分枝桿菌活菌菌液致敏組豚鼠注射0.5 ml/只，飼養于負壓動物房的負壓動物籠具中。

4.重組結核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白的制備：采用基因工程手段構建ESAT6－CFP10融合蛋白表達載體，篩選陽性菌落并測序正確，建立生產用種子批系統［14］。將工作種子通過復蘇、傳代后發酵，最終通過純化獲得重組結核桿菌ESAT6－CFP10目的蛋白。

5.致敏動物皮試：在致敏動物3～4周后，將豚鼠背部脊柱兩側去毛，以輪圈法［15］分別于豚鼠皮內注射1μg/ml和5μg/ml的ESAT6－CFP10蛋白、1μg/ml和5μg/ml的PPD－B、TB－PPD（50 IU/ml）各0.1 ml。于注射后24、48 h觀察局部硬結的縱徑與橫徑，根據48 h的反應結果進行判定，平均硬結反應直徑≥5 mm判為陽性［16］。

結 果

一、臨床常見致病分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應結果

皮試反應顯示，TB－PPD、ESAT6－CFP10蛋白以及PPD－B對結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、卡介菌（疫苗株）和非洲分枝桿菌活菌致敏豚鼠的皮試反應均呈陽性，而ESAT6－CFP10蛋白對卡介菌（疫苗株）、結核分枝桿菌死菌致敏豚鼠的皮試反應呈陰性（圖1）。硬結直徑統計及陽性比例見表1。

二、常見環境分枝桿菌組致敏豚鼠的皮試反應結果

PPD－B對鳥、胞內、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發、草、微黃分枝桿菌這12種常見環境分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應均呈陽性，而ESAT6－CFP10蛋白以及TB－PPD對上述分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應均呈陰性，48 h的皮試硬結直徑與陽性比例結果見表2。

討 論

圖1 致敏豚鼠皮試硬結狀況

表1 臨床常見致病分枝桿菌組致敏豚鼠致敏后48 h的皮試平均硬結直徑及陽性比例

表2 常見環境分枝桿菌致敏組豚鼠48 h皮試平均硬結直徑及陽性比例

多年來，結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin testing，TST）一直是篩選結核分枝桿菌潛伏感染和結核病輔助診斷的重要方法。但TST所用PPD所包含的抗原為常見致病性分枝桿菌（結核、牛和非洲分枝桿菌）、環境中的分枝桿菌（鳥、胞內、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發、草、微黃等分枝桿菌）及BCG所共有，診斷特異度較差，不能區分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結核分枝桿菌感染，更不能鑒別結核分枝桿菌感染者體內有無存活的結核分枝桿菌；而卡介苗在世界范圍內廣泛接種會干擾TST的檢測，減少其診斷效果。對于某些嚴重結核病、血行散播性肺結核或HIV感染者等免疫力低下者，TST診斷的敏感度也不理想。因此，尋找既能區別卡介苗接種還是結核分枝桿菌感染、結核分枝桿菌感染者體內有無活菌又敏感度高的診斷方法非常重要。

Maheiras等［17］確定了結核分枝桿菌基因的差別區（regions of difference，RD），其中最為重要的RD1區基因為結核分枝桿菌和牛分枝桿菌有毒株所特有，而BCG和大多數非結核分枝桿菌缺失。ESAT6是RD1區發現較早的重要分泌型蛋白，由Rv3875基因編碼，全長285個堿基對，編碼95個氨基酸。1998年Berthet等［18］在研究ESAT6基因表達調控機制時，發現了Lhp基因。Lhp基因即Rv3874基因，位于ESAT6基因上游34 bp處，和ESAT6基因處于同一操縱單元。此基因編碼100個氨基酸，又由于其基因產物在早期培養濾液中出現，因此命名為培養濾液蛋白10（CFP 10）。ESAT6基因和CFP10基因處于同一操縱子中，一起進行協同轉錄。基因產物均為分泌性蛋白，存在于結核分枝桿菌的早期培養濾液中。

ESAT6蛋白和CFP10蛋白作為結核分枝桿菌的特異性抗原，兩者具有大致相同的菌間分布特性。根據Swissprot和Genbank數據庫資料分析，ESAT6基因和CFP10基因嚴格限制于結核分枝桿菌復合群和4種非典型分枝桿菌（堪薩斯、海、微黃和蘇加分枝桿菌）中，BCG和大部分非結核分枝桿菌缺失［16，19－20］。雖然研究兩基因菌間分布特性所用到的菌株不完全相同，但實驗結果足以說明CFP10和ESAT6基因具有大致相同的菌間分布，即兩基因嚴格限制于結核分枝桿菌復合群，BCG和大部分的非結核分枝桿菌缺失。

目前國內外研究較多的是將CFP10和ESAT6蛋白作為刺激原，應用體外酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或酶聯免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）技術診斷結核病。Ravn等［21］的一項研究結果顯示：在39名無結核分枝桿菌暴露史的BCG接種健康人中，PPD－ELISA 的陽性率為100%，而CFP10－ESAT6－ELISA 陽性僅有1例，具有良好的診斷特異度。對痰菌陰性結核患者用ESAT6和CFP10抗原進行體外診斷，87%的患者能夠被發現，敏感度較好。

近幾年，以ESAT6為抗原作為結核診斷的皮試試劑研究也較多。國內張靈霞等［4］報道將ESAT6作為皮膚反應試劑用于結核病診斷，發現ESAT6皮試可以很好地區分結核分枝桿菌感染和BCG致敏的動物。國內徐苗等［5］對ESAT6基因進行改構得到重組11 k Da蛋白，在動物實驗研究發現，重組結核分枝桿菌11 k Da蛋白對結核分枝桿菌活菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗為陽性，而對滅活結核分枝桿菌、卡介菌和其他非結核分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗均為陰性。Aggerbeck等［6］研究發現重組ESAT6蛋白在豚鼠、小鼠和狗等動物上均有較好的安全性，皮試濃度從1μg到1000μg僅有個別輕微不良反應出現。目前，ESAT6蛋白作為皮試試劑已經進入Ⅰ期臨床，國外Arend等［7］隨機雙盲臨床實驗顯示，ESAT6有很好的臨床安全性和生物活性。國內 Wu等［8］報道在小部分志愿者中進行ESAT－6蛋白皮試，結果顯示ESAT－6蛋白僅誘導結核患者陽性反應，BCG接種健康者為陰性反應。

目前以CFP－10蛋白作為皮試試劑，僅在動物實驗見到相關報道，尚無臨床試驗數據。國外Van Pinxteren等［9］研究發現CFP10和ESAT6兩種蛋白，均能很好的誘導結核分枝桿菌致敏豚鼠的皮試呈陽性反應。而在BCG和鳥分枝桿菌致敏豚鼠中，兩種蛋白皮試結果陰性或僅有個別陽性，敏感度和特異度均好于PPD，但CFP10蛋白的特異度低于ESAT6蛋白。同時IFN－γ體外刺激試驗結果顯示兩種蛋白聯用的敏感度和特異度均高于單一蛋白［9］。Weldingh等［10］的實驗結果也顯示兩種蛋白聯用的敏感度與PPD相近，較單一抗原敏感度高。

本研究利用基因工程技術融合表達CFP10－ESAT6蛋白，該蛋白僅對活結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌致敏動物呈陽性反應，對卡介菌接種或死結核分枝桿菌及常見環境分枝桿菌致敏動物均呈陰性反應，提示CFP10－ESAT6蛋白如果作為皮試試劑能夠鑒別BCG接種和結核分枝桿菌感染，可為結核病的輔助診斷提供強有力的支持。如能應用于臨床，將對結核病的診斷及傳播控制有著非常重要的意義。但是由于本研究實驗組數較多，工作量比較大，再加上課題時間的限制，每組實驗只采用了5只豚鼠，統計學上可能存在一定的誤差，這也是今后進一步深入研究所需要改進之處。

由于中國屬于結核病高發地區，可為臨床研究規模和內容提供良好空間，如果上述動物實驗的數據能在人體得到驗證，該結果將為臨床上結核病的早期診斷和鑒別診斷提供重要的依據，為結核病的控制節省大量的資源。

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