高通量篩選在微生物制藥中的應用進展

沈辰，鄭珩，顧覺奮

高通量篩選（high throughput screening，HTS）又稱大規模集群式篩選，是由高容量化合物庫、自動化操作、高靈敏度檢測、高特異篩選模型、高效率數據處理 5 個子系統有機組合而成，是一種新型、高自動化、高靈敏度、高通量的發現新藥的篩選技術。其理論基礎是反向藥理學（reverse pharmacology），即基于受體、酶及離子通道等分子、細胞水平藥物作用靶點，從現有化合物庫中篩選出具有生物活性的先導化合物，在此基礎上再進行組織、器官及疾病相關動物模型研究。

利用藥物作用靶點進行藥物篩選，已成功地發現了大批臨床用藥。如血管緊張素轉化酶抑制劑卡托普利、依那普利等降血壓藥物，β-腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾、阿替洛爾等，都是利用分子靶點篩選發現并經過進一步研究而成為臨床應用的藥物。這些研究成果更加強了人們對高通量藥物篩選的信心。目前，世界上大型制藥企業都無一例外地將其作為驅動新藥發現的強力引擎，紛紛引進新藥研發領域，使高通量篩選的形式和內容不斷豐富發展[1]。近年來，高通量篩選技術不僅廣泛應用于化學新藥的篩選，同時在生物催化劑[2]，RNAi[3]，蛋白質類藥物[4]等的篩選過程中也有所應用。

高通量篩選技術具有以下幾方面的發展趨勢：①采用基于細胞的分析篩選方法，可直接在活細胞內檢測化合物，提高篩選的準確性；②采用精確的檢測技術，使之能夠在相同的分析過程中兼顧效率和特異性；③基于功能基因組學的藥物高通量篩選逐漸受到重視并應用；④開始分析和處理工業中的實際問題。該系統在后基因組時代研究和藥物發現之間架起橋梁，將很快滲入到未來市場中，打破從基因到藥物研發鏈條中的瓶頸[5]。

1 高通量篩選應用于微生物藥物早期發現中的優勢

高通量篩選技術主要應用于篩選利用組合化學制備的大規模化合物庫[6]，雖然篩選效率大為提高，但得勢不得力，其獲得新的化學實體的數量并沒有顯著提高，而且隨著新藥標準的提高，新的化學實體數量反而呈下降趨勢。因此，天然產物作為創新藥物的篩選資源再次受到重視[7]。

相對于動植物代謝產物來講，微生物次級代謝產物具有更易開發利用、不破壞生態環境、可通過發酵大量獲得和易于采用生物技術等優點[8]。目前已有眾多微生物次級代謝產物開發成為藥物。抗生素作為其中的典型代表，在治療感染性疾病，保障人類健康方面取得了令人矚目的成就。同時它不僅應用于臨床，也可用于農業和畜牧業，是一類應用最廣泛的藥物。隨著生命科學與醫藥學的發展，由微生物產生的具有其他生理活性的物質也不斷被發現，如受體拮抗劑和激動劑、酶抑制劑和誘導劑、免疫調節劑等，更豐富了微生物藥物生理活性的多樣性。

近年來隨著人們對極端環境微生物，海洋微生物的探索，發現了大量未知的微生物物種及微生物次級代謝產物。同時伴隨著生物技術的發展，在基因工程、代謝工程、組合生物合成的推動下，通過構建工程菌株，獲得了大量結構新穎的微生物次級代謝產物，擴充著微生物次級代謝產物的種類和數量[9]。利用有效的篩選手段對其進行篩選，將極大地促進創新型微生物藥物的早期發現和苗頭化合物的獲得。而傳統的篩選方法由于處理量少，效率低，面對大批量化合物處理時，需要消耗更多的人力和物力，已不能適應當前大規模微生物代謝產物的篩選要求。高通量篩選技術彌補了傳統篩選方法的不足，能夠快速而高效地在龐大的微生物次級代謝產物庫中發現目標化合物。隨著微生物次級代謝產物庫的建立和日趨完善，微生物次級代謝產物的篩選更加方便和快捷，對我國創新微生物藥物的開發起到極大的推動作用。

2 微生物藥物高通量篩選樣品庫發展現狀

目前微生物制藥領域中可供高通量篩選的樣品資源庫主要包括微生物菌株庫及微生物發酵產物提取品庫等。

隨著化學分離手段的進步與發展，以及我國在藥物研發經費投入的加大，在我國開展規模化微生物次級代謝產物純品庫已經成為可能，而且也十分必要，這是創新型微生物藥物快速高效發現的必然要求。

在我國，科技部自“九五”期間開始資助支持國內籌建國家新藥（微生物）篩選實驗室，“十五”、“十一五”期間又以篩選平臺的形式資助支持微生物藥物高效篩選。十年來，我國微生物藥物的篩選技術有了長足的進步。在藥物篩選微生物資源方面已經建立了近 15 萬株的篩選用菌株庫和 20 萬個微生物發酵液提取品的樣品庫。高通量微生物藥物篩選模型已達到 150 種，年篩選量已由“十五”期間的20 萬樣次，發展到“十一五”期間的 100 萬樣次。通過大量的規模化的篩選，已經獲得一批藥物先導化合物和藥物候選物，有些已經進入臨床前研究階段。就微生物藥物的篩選規模和水平來講，我國的創新微生物藥物篩選已達到國際先進水平[8, 10]。

3 高通量篩選在微生物制藥領域中的應用

高通量篩選技術不僅推動了創新型化學類新藥的研發進程，近年來，在創新型微生物類新藥研發過程中的應用也日趨廣泛。以下主要介紹近年來高通量篩選技術在微生物制藥領域應用最為廣泛的兩個方面——先導化合物的發現及菌種篩選。

3.1 在微生物來源的先導化合物發現中的應用

3.1.1 針對微生物代謝產物化合物庫的高通量篩選 針對微生物代謝產物化合物庫的高通量篩選過程一般為首先構建適宜的高通量篩選模型，再利用微量滴定板對微生物代謝產物庫中的化合物進行高通量篩選，通過相應的檢測技術篩選目標化合物，最后對目標化合物進行活性驗證，以獲得可供進一步開發的先導化合物。

正如前文所述，國家新藥（微生物）篩選中心樣品庫的建立和發展已極大地促進了微生物藥物先導化合物的發現，相關研究者根據不同靶點，對樣品庫中的化合物進行篩選，已經獲得了大量微生物來源的具有不同生理活性的先導化合物。

在丙型肝炎病毒（HCV）絲氨酸蛋白水解酶抑制劑的高通量篩選過程中，李健蕊等[11]利用基因重組的方法將含有絲氨酸蛋白水解酶基因的質粒轉化到大腸桿菌中表達，結合熒光共振能量轉移法（FRET）成功構建了適用于高通量篩選的特異性蛋白酶抑制劑篩選模型。利用此模型，對樣品庫中的 4000 個化合物進行初步篩選，獲得了 4 個具有抗丙肝病毒活性的化合物。

在以 FOXP3 為靶點的免疫抑制劑的高通量篩選過程中，巫曄翔等[12]將轉錄因子 FOXP3 基因啟動子克隆至含有與報告基因 β-內酰胺酶相偶聯的表達載體中，并轉染至Jurkat 細胞株中穩定表達，建立了適宜高通量篩選的模型，進而對樣品庫中 2500 余種化合物進行篩選，獲得 4 個具有免疫抑制活性的化合物。

在以 ApoA-1 為靶點的基因表達上調劑的高通量篩選過程中，杜郁等[13]構建了重組熒光素酶報告基因質粒并轉染至人肝癌細胞 HepG2，利用熒光素酶表達活性的變化為檢測指標，成功構建了 ApoA-1 基因表達上調劑高通量篩選模型。對樣品庫中 5000 余種化合物進行篩選，獲得4 個具有治療動脈粥樣硬化潛力的活性化合物。

由此可見，以微生物代謝產物化合物庫為對象的篩選，與組合化學品庫的高通量篩選雖然篩選對象不同，但原理與方法基本相同，所以該方法較為成熟、規范。

3.1.2 針對微生物發酵液提取品庫的高通量篩選 微生物代謝產物中含有大量不為人知的新型化合物，在現有的微生物代謝產物化合物庫中不能保證完全收納。同時，不同類型的微生物代謝產物的藥理活性會有所側重，在針對某一靶點篩選先導化合物時，選擇特定類型的微生物的代謝產物提取物進行篩選，將會提高效率，事半功倍。所以針對微生物發酵液提取品的高通量篩選是十分必要的，是對微生物天然代謝產物化合物庫高通量篩選的重要補充。

針對微生物發酵液提取品庫的高通量篩選過程，通常是將微生物發酵提取物加入到微量滴定板中，通過相應的篩選模型，從大規模的微生物發酵液提取物中獲得目標陽性樣品——特定菌株發酵液提取物，進而對特定菌株進行放大發酵、活性產物提取、分離，獲得活性組分后進行結構分析和藥理活性測定，以得到先導化合物。

在 H1N1 神經酰胺酶抑制劑的篩選過程中，Lin 等[14]利用基因工程手段將截短型 H1N1 神經酰胺酶基因克隆到載體中，構建重組質粒并轉化至畢赤酵母中，獲得了能夠分泌表達截短型 H1N1 神經酰胺酶的重組菌株，構建了新型神經酰胺酶抑制劑的高通量篩選模型。利用此模型對20 000 多個微生物發酵液提取物進行了篩選，獲得 6 種活性提取物。

近年來，隨著海洋微生物，極端環境微生物的探索與開發，大量的新型菌株以及獨特結構的次級代謝產物被發現，這為創新微生物藥物的研發開辟了新的思路。科研人員通過對大量的海洋或極端環境等新分離菌株發酵提取品進行高通量篩選，獲得了更多具有獨特生理活性的天然產物及其生產菌株。

在鈣調磷酸激酶抑制劑的篩選過程中，Margassery 等[15]對海洋微生物發酵提取品進行了高通量篩選。研究者將含有CDRE::lacZ 融合基因的 Pmrk212 質粒導入酵母細胞中，獲得酵母報告菌株，以紫外吸收光譜作為檢測方法，構建了鈣調磷酸激酶抑制劑的高通量篩選模型。然后對 81 個海洋海綿動物中所分離的微生物發酵提取物進行篩選，發現3 個菌株的發酵提取物具有鈣調磷酸激酶抑制活性，其菌株編號分別為 SM8、FMK7A、FMK1B。

總之，針對微生物代謝產物的高通量篩選，可分別以微生物天然代謝產物化合物庫及微生物發酵提取物為篩選對象來進行，兩者互相滲透，相輔相成，其最終目標均為高效率地獲得藥物先導化合物。近年來，高通量篩選技術在微生物來源的先導化合物早期發現過程中的應用在國內蓬勃發展，并在創新型微生物藥物的開發過程中發揮了極大的作用。表 1 總結了國內近年來微生物代謝產物高通量篩選的部分案例。

3.2 在菌株篩選中的應用

微生物具有數量大，種類多，分布廣的特點，絕大部分微生物菌種并未充分開發，潛力巨大。因此，從大量的微生物菌株中篩選出所期望的目標菌株，在微生物藥物發現的過程中具有重要的意義。

針對微生物菌株的高通量篩選，其目的是獲得具有某一特定性質的菌株，篩選對象可以是自然界中分離所得的菌株，可以是原始菌株的突變株，也可以是通過生物技術改造的工程菌株等。在篩選過程中，開發合適的培養基，對微生物進行適宜微量滴定板的縮小化培養，以便將微生物菌株直接置于微量滴定板中進行生長繁殖。利用多種檢測技術對目的產物的濃度或菌株的各項生理生化指標進行測定，獲得陽性菌株，進而通過復篩，最終獲得目的菌株——某一特定性質的菌株。

表 1 國內微生物代謝產物高通量篩選案例小結

表 2 國內微生物菌株高通量篩選案例小結

Gao 等[19]利用高通量篩選方法，從原始菌株 Streptomyces avermitilis 系列突變株中成功篩選出阿維菌素高產菌株，其產量提高 60%。在高通量篩選模型的構建過程中，研究者利用固體培養基代替傳統的液體培養基，從而可在 96 孔微量滴定板中成功培養 S.avermitilis 系列突變株。同時利用245 nm 紫外吸收值檢測阿維菌素的產量來代替高效液相色譜的檢測方法，適合于對微量滴定板的檢測。利用建立好的高通量篩選模型，對由原始菌株突變所獲得的 738 株突變株進行了高通量篩選。其中在初篩（preliminary screen）過程中采用了高通量篩選技術。經過初篩共獲得 116 株進入復篩階段（second screen），最終證實有 38 株的產量比原始菌株提高了 10%。

針對微生物菌株的高通量篩選，是高通量篩選技術在微生物制藥領域中的一個獨特的應用，在我國，近年來也涌現出一些相關的案例（表 2）。

4 小結

微生物代謝產物因其種類繁多，結構復雜，可廣泛應用于醫藥、食品、化工、材料等領域中，是自然界的寶貴財富，但正是因其龐大的數量，一般的篩選方法僅能對少量的代謝產物或菌株進行篩選，這便大大限制了人類對于微生物天然代謝產物的開發利用。高通量篩選作為 20 世紀 80 年代興起的方法，如今已經廣泛應用于化合物篩選中。近幾年，高通量篩選新技術的發展也大大提高了篩選效率，推動了一大批化合物進入臨床研究。在微生物制藥領域中高通量篩選也逐漸滲入并發揮了積極的作用，但還存在一些問題：第一，高通量篩選主要關注于小分子化合物庫的篩選，而在微生物代謝產物中的篩選涉足較少；第二，專門的微生物代謝產物庫并未系統化建立；第三，新的作用靶點和微量分析方法還需要進一步探索。總之，高通量篩選作為新興的篩選手段，與現代藥物篩選技術結合并應用于微生物代謝產物的篩選過程中，將會極大地推動微生物制藥的發展。

[1] Mayr LM, Bojanic D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(5):580-588.

[2] Wahler D, Reymond JL. High-throughput screening for biocatalysts.Curr Opin Biotechnol, 2001, 12(6):535-544.

[3] Theis M, Buchholz F. High-throughput RNAi screening in mammalian cells with esiRNAs. Methods, 2011, 53(4):424-429.

[4] Capelle MA, Gurny R, Arvinte T. High throughput screening of protein fomulation stability: practical considerations. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 65(2):131-148.

[5] Mishra KP, Ganju L, Sairam M, et al. A review of high throughput technology for the screening of natural products. Biomed Pharmacother, 2008, 62(2):94-98.

[6] Macarron R, Banks MN, Bojanic D, et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(3):188-195.

[7] Wang BC, Deng J, Gao Y, et al. The screening toolbox of bioactive substances from natural products: a review. Fitoterapia, 2011, 82(8):1141-1151.

[8] Si SY, Jiang W, Bai SK. Advances in microbial drug research and development. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):81-83. (in Chinese)司書毅, 姜威, 白碩可. 微生物藥物研究進展與發展趨勢. 中國醫藥生物技術, 2011, 6(2):81-83.

[9] Knight V, Sanglier JJ, DiTullio D, et al. Diversifying microbal natural products for drug discovery. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(5-6):446-458.

[10] Jiang W, Si SY, Chen XP, et al. Development and application of microbial natural products database. Chin J Antibiot, 2006, 31(2):119-121. (in Chinese)姜威, 司書毅, 陳湘萍, 等. 微生物天然產物數據庫的建立及應用.中國抗生素雜志, 2006, 31(2):119-121.

[11] Li JR, Wu YB, Si SY, et al. Establishment and application of high throughput screening model for hepatitis C virus NS3-4A protease inhibitors in vitro. Acta Acad Med Sinicae, 2011, 33(1):98-101. (in Chinese)李健蕊, 武燕彬, 司書毅, 等. 丙型肝炎病毒蛋白酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應用. 中國醫學科學院學報, 2011, 33(1):98-101.

[12] Wu YX, Si SY, Jiang JD, et al. Screening model for immuning inhibitors as target for transcription factor FOXP3. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(1):2-6. (in Chinese)巫曄翔, 司書毅, 蔣建東, 等. 以 FOXP3 為靶點的免疫抑制劑藥物篩選模型的建立. 中國醫藥生物技術, 2011, 6(1):2-6.

[13] Du Y, Wang L, Wang LF, et al. Estabilishment of a high-throughput screening model for identifying up-regulator of human Apo A-I expression. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183. (in Chinese)杜郁, 王麗, 王麗非, 等. 以Apo A-I 為靶點的基因表達上調劑篩選模型的建立. 中國醫藥生物技術, 2011, 6(3):178-183.

[14] Lin J, Hu HF, Hu YJ, et al. Expression of a truncated H1N1 neuraminidase and high-throughput screening of its inhibitor. Chin J Nat Med, 2011, 9(5):380-384.

[15] Margassery LM, Kennedy J, O'Gara F, et al. A high-throughput screen to identify novel calcineurin inhibitors. J Microbiol Methods, 2012,88(1):63-66.

[16] Liu XH, Hong B, Wang LF, et al. Establishment of a drug screening model for identifying up-regulator of human high density lipoprotein receptor. Acta Acad Med Sinicae, 2004, 26(4):354-358. (in Chinese)劉曉輝, 洪斌, 王麗非, 等. 人高密度脂蛋白受體表達上調劑篩選模型的建立. 中國醫學科院學報, 2004, 26(4):354-358.

[17] Qi XZ, Ren LM, Zheng F, et al. High-throughput screening of human pancreatic α-amylase inhibitors. Acta Microbiologica Sinica, 2011,51(8):1106-1112. (in Chinese)齊西珍, 任麗梅, 鄭芳, 等. 人胰腺 α-淀粉酶抑制劑高通量篩選模型的建立及其應用. 微生物學報, 2011, 51(8):1106-1112.

[18] Zhang L, Yan K, Zhang Y, et al. High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment of fungal infections. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(11):4606-4611.

[19] Gao H, Liu M, Zhang X, et al. Identification of avermectin-highproducing strains by high-throughput screening methods. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(4):1219-1225.

[20] Pei G, Dai HQ, Ren B, et al. Exploiting bioactive Enediynes from marine microbe based on activity and gene screening. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(4):472-477. (in Chinese)裴剛, 代煥琴, 任彪, 等. 基于活性和基因從海洋微生物中篩選烯二炔類抗生素. 微生物學報, 2010, 50(4):472-477.

[21] Yang Y, Yuan S, Dai YJ, et al. Microplate for high throughput screening of 6-hydroxynicotinic acid transforming strains. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(1):112-115. (in Chinese)楊瑤, 袁生, 戴亦軍, 等. 基于微孔板的高通量篩選 6-羥基煙酸轉化菌方法的建立. 微生物學報, 2008, 48(1):112-115.