紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠模型的抗衰老作用研究

申佳佳，苑隆國(guó)，李電東，王真

紅景天（Rhodiola rosea L.）具有抗缺氧、抗疲勞、抗血乳酸含量增加等作用，而紅景天苷（salidroside，SAL）作為紅景天中重要有效成分，也具有多種藥理作用，包括保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、增加機(jī)體免疫系統(tǒng)功能以及干預(yù)衰老等[1]。有報(bào)道證實(shí)紅景天及其提取成分能降低正常小鼠經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后其體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)（lipid peroxidation，LPO）和脂褐素的含量，并且提高超氧化物歧化酶（superoside dismutase，SOD）及谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性[2-4]，我們以前的研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞具有良好的干預(yù)衰老和抗氧化效應(yīng)[5]，但紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化效應(yīng)究竟如何，目前報(bào)道較少。本文通過(guò)給自然衰老小鼠口服一定劑量的紅景天苷，測(cè)定其對(duì)動(dòng)物體內(nèi)不同器官組織的抗氧化酶活性及過(guò)氧化脂質(zhì)和脂褐素水平的影響，以進(jìn)一步探索紅景天苷體內(nèi)干預(yù)衰老的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16 月齡 ICR 雌性小鼠，體重33 ～ 45 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0008。

1.1.2 主要試劑 人參皂苷（ginsenoside，GS）購(gòu)自吉林大自然生物技術(shù)公司；紅景天苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸、四乙氧基丙烷均為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 DU800 型紫外分光光度計(jì)為美國(guó) Beckman 公司產(chǎn)品； RF-5000 型熒光分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品；Centrifuge 5424型臺(tái)式高速離心機(jī)為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品；Mikro 200R 型冰凍高速離心機(jī)為德國(guó)賀力士公司產(chǎn)品；漩渦振蕩器為天津泰普公司產(chǎn)品；恒溫水浴為上海榮華儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 自然衰老小鼠分組及給藥情況 48 只自然衰老小鼠隨機(jī)分為 4 組，即對(duì)照組、兩個(gè)不同劑量紅景天苷（0.2 g/kg 和 1.0 g/kg）給藥組和人參皂苷陽(yáng)性藥物組（0.2 g/kg）。對(duì)照組灌以同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃 60 d。

1.2.2 組織勻漿制備 灌胃 60 d 后，摘眼球取足夠量血清，然后脫頸椎處死小鼠，迅速取出小鼠的相應(yīng)臟器，每種組織稱取一定量，在勻漿器中用生理鹽水分別制成 5% 組織勻漿生理鹽水混懸液，離心后取上清，進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定[6-8]。

1.2.3 血清或組織中 SOD 活性的測(cè)定 SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，能清除超氧負(fù)離子自由基，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織免受自由基的損害，延緩機(jī)體衰老過(guò)程。在老齡生物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)SOD 等抗氧化酶活性較低[9]。我們前期研究證明紅景天苷的毒性劑量大于 5 g/kg。本實(shí)驗(yàn)選用 0.2 g/kg及 1.0 g/kg 作為紅景天苷給藥劑量，同時(shí)設(shè)人參皂苷（0.2 g/kg）陽(yáng)性藥物組。

血清樣本 20 μl（發(fā)生溶血的樣本不計(jì)入結(jié)果）或組織勻漿上清 10 ～ 40 μl，測(cè)定 SOD 活性。

SOD 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線制作：將 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成 750 U/ml 的溶液，稀釋 50 倍至 15 U/ml，使用分光光度計(jì)在 530 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定不同量的 SOD 標(biāo)準(zhǔn)液 OD 值，計(jì)算百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以 SOD 活性單位U/ml 為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每毫升反應(yīng)液中 SOD抑制率達(dá)到 50% 時(shí)所對(duì)應(yīng)的 SOD 量為一個(gè)單位。

SOD 百分抑制率 =（對(duì)照管 OD 值 － 測(cè)定管 OD 值）/對(duì)照管 OD 值 × 100%，

SOD 活性（U/ml）= SOD 百分抑制率 × 12 ×樣品稀釋倍數(shù)/取液量。

1.2.4 血清或組織中 LPO 生成水平測(cè)定 LPO是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，隨年齡的增加而增高。它可作為衰老的一個(gè)定量指標(biāo)，也可以用于評(píng)價(jià)機(jī)體的生命活力。LPO 經(jīng)過(guò)氧化分解后形成丙二醛（malondialdehyde，MDA），MDA含量即代表 LPO 水平。MDA 在酸性條件下與硫代巴比妥酸反應(yīng)，生成 MDA-TBA 復(fù)合物，呈粉紅色，可采用分光光度法在 532 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)。四乙氧基丙烷與過(guò)氧化脂質(zhì)在同一條件下能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛。因此，可用四乙氧基丙烷作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

血樣：血清用量 0.1 ml，不加稀釋，發(fā)生溶血的樣本不計(jì)入結(jié)果。

組織樣本：取臟器 200 mg，生理鹽水沖洗、拭干、準(zhǔn)確稱重、剪碎，置勻漿器中，加入 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，20 000 r/min 勻漿 10 s，間歇 30 s，反復(fù) 3 次，制成 5% 勻漿，845 × g 離心 5 ～10 min，取上清待測(cè)。

LPO 含量（nmol 每克組織或血清）=（樣品管 OD 值 － 空白管 OD 值）× 40 /（四乙氧基丙烷 OD 值 － 空白管 OD 值）× 0.1 × 1000

1.2.5 組織中脂褐素水平測(cè)定 脂褐素是某些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的不溶性顆粒，其含量一般隨年齡的增長(zhǎng)而增多，是衰老過(guò)程中具有特征性的物質(zhì)之一。脂褐素作為膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過(guò)氧化后的一種復(fù)合產(chǎn)物，可反映細(xì)胞的過(guò)氧化程度，甚至可推斷細(xì)胞衰老的程度。

每只小鼠取相應(yīng)組織 200 mg，加入氯仿-甲醇（2:1）混合溶液 4 ml，在 45 ℃ 水浴中以2500 r/min 速度勻漿 1 min，制成 5% 勻漿。隨后加入 4 ml 蒸餾水，劇烈振蕩 1 min，845 × g 離心10 min 后樣品分為 3 層，小心吸去水相，穿過(guò)中層將下層氯仿-甲醇液取出。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇 0.2 ml，輕輕振蕩均勻，置紫外燈下照射30 s 后測(cè)定熒光強(qiáng)度。以硫酸奎寧（0.1 μg/ml）為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，在狹縫 4.4 nm、靈敏度 3.6 ng/ml、激發(fā)波長(zhǎng) 360 nm、發(fā)射波長(zhǎng) 450 nm、熒光強(qiáng)度約為55 ～ 60 U 條件下測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度。氯仿甲醇混合液為空白對(duì)照。

脂褐素含量（μg 每克組織）= A × B × C，其中：

A =（樣品熒光強(qiáng)度 －空白熒光強(qiáng)度）/硫酸奎寧熒光強(qiáng)度；

B = 硫酸奎寧濃度（0.1 μg/ml）；

C = 勻漿體積/樣品重量。

1.2.6 血清或組織中 GSH-Px 活性測(cè)定 GSH-Px是機(jī)體中重要的一種抗氧化酶，能間接減少體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)的形成。該酶活性也隨增齡降低。

組織上清液制備：取適量所需臟器，冰浴剪碎，加冷 0.2 mol/L 磷酸緩沖液，以 20 000 r/min 勻漿10 s，間歇為 30 s，反復(fù) 3 次，制成 5% 組織勻漿。4 ℃，6630 × g 離心 10 min，取上清待測(cè)。

谷胱甘肽（GSH）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取 1.0 mmol/L GSH 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于10 ml 小容量瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑 8 ml，用雙蒸水稀釋至 10 ml 刻度，即得濃度為 0、20、40、60、80、100 μmol/L 的 GSH 標(biāo)準(zhǔn)液。取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液各 2 ml，放入試管中，加入 0.32 mol/L磷酸氫二鈉 2.5 ml，比色前加入 DTNB 顯色液0.5 ml，5 min 內(nèi)于 423 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值，以雙蒸水調(diào)零點(diǎn)。以 GSH 含量（μmol/L）為橫坐標(biāo)，OD423值為縱坐標(biāo)，即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程。

血清 GSH-Px 活性計(jì)算：規(guī)定每毫升血清每分鐘扣除非酶反應(yīng)的 log[GSH] 降低后，使 log[GSH]每降低 1 為一個(gè)酶活單位。GSH-Px 活性單位（U/ml）= log[非酶管 OD 值 － 空白管 OD 值]－log[樣品管 OD 值 － 空白管 OD 值]/ 0.012。

組織 GSH-Px 活性計(jì)算：規(guī)定每毫克組織蛋白每分鐘扣除非酶反應(yīng)，使 GSH 濃度降低 1 μmol/L為一個(gè)酶活單位。GSH-Px 活性單位（U 每毫克蛋白）=（非酶管 OD － 樣品管 OD）× A × 5 / 3 × 樣品蛋白含量，其中，A = GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠多種器官組織 SOD活性的影響

通過(guò)檢測(cè)不同給藥組自然衰老小鼠體內(nèi)血清、心臟、肝臟、腎臟和大腦等器官組織的 SOD 含量的變化發(fā)現(xiàn)，高劑量紅景天苷給藥組自然衰老小鼠的血清、心臟、肝臟和腎臟組織中的 SOD 活性均比未加藥對(duì)照組顯著升高（圖 1）。

圖 1 不同組別老年小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟及大腦中 SOD 的活性（與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 1 The activity of SOD in the palsma, heart, liver, kidney and brain of the aged mice (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01 vs control)

圖 2 不同組別老年小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟及大腦中 MAD 水平（與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 2 MAD level in the palsma, heart, liver, kidney and brain of the aged mice (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01 vs control)

2.2 紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠多種器官組織 LPO生成的影響

由圖 2 的結(jié)果可以看出，與人參皂苷類似，高劑量紅景天苷給藥組小鼠的血清、肝臟、腎臟MDA 含量與未加藥組相比顯著下降（P ＜ 0.05），其大腦組織 MDA 水平也出現(xiàn)一定下降，心臟變化則不明顯。

2.3 紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠多種器官組織脂褐素含量的影響

由圖 3 可以看出，高劑量紅景天苷給藥組和人參皂苷組小鼠的脂褐素含量在肝臟、腎臟及大腦組織中與未加藥組相比均降低，其中人參皂苷組動(dòng)物肝臟中的脂褐素水平降低最為顯著（P ＜ 0.01），而高劑量紅景天苷給藥組動(dòng)物的大腦中脂褐素含量降低最顯著（P ＜ 0.05）。

2.4 紅景天苷對(duì)自然衰老小鼠體內(nèi)多種器官組織GSH-Px 活性的影響

由圖 4 結(jié)果可見(jiàn)，與未加藥組相比，人參皂苷組動(dòng)物血清、心臟和肝臟的 GSH-Px 活性均顯著升高，而高劑量紅景天苷給藥組在這 3 種器官組織的 GSH-Px 活性變化不明顯。但在腎臟和大腦組織中，高劑量紅景天苷給藥組的 GSH-Px 活性均優(yōu)于人參皂苷組以及未加藥對(duì)照組。

3 討論

圖 3 不同組別老年小鼠心臟、肝臟、腎臟及大腦中脂褐素（Lf）的水平（與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 3 The concentration of lipofascin (Lf) in the heart, liver, kidney and brain of the aged mice (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01 vs control)

圖 4 不同組別老年小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟及大腦中 GSH-Px 的活性（與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 4 The activity of GSH-Px in the palsma, heart, liver, kidney and brain of the aged mice (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01 vs control)

衰老是生理功能的時(shí)間依賴性衰退，其與機(jī)體內(nèi)各種物質(zhì)代謝功能缺陷的逐漸積累有關(guān)。研究人員認(rèn)為，線粒體呼吸作用的副產(chǎn)物活性氧自由基所引起的過(guò)氧化反應(yīng)是引起各種物質(zhì)代謝通路損傷乃至衰老的重要原因之一[10]?；钚匝踝杂苫且活惛叨然钚晕镔|(zhì)，可直接或間接發(fā)揮其氧化劑的作用，氧化細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸形成 LPO，進(jìn)一步形成脂褐素。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、脂褐素可造成功能蛋白損傷、DNA 復(fù)制功能減弱以及 RNA 合成受阻，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，排擠細(xì)胞器，從而引起細(xì)胞衰老和死亡[11]。已有研究證實(shí)，一些抗氧化酶如 SOD、GSH-Px 等能清除超氧負(fù)離子自由基，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織不受自由基的損害，延緩機(jī)體衰老過(guò)程，這些抗氧化酶的增齡性失活可能是由于編碼抗氧化酶的基因及抗氧化酶自身受到自由基的化學(xué)損傷所引起[12]。

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，紅景天具有抗缺氧，抗疲勞，抗血乳酸含量增加的作用[13]。紅景天苷及紅景天苷樣化合物是紅景天的主要活性成分，其中紅景天苷被認(rèn)為是紅景天保健功效的重要成分，該成分含量的高低是評(píng)價(jià)該屬植物藥用價(jià)值的重要指標(biāo)之一。已有研究表明，紅景天苷可以激活能量代謝中的某些酶或者輔酶，提高組織對(duì)能量的利用率，延長(zhǎng)供氧時(shí)限，有效提高骨骼肌的應(yīng)激能力，減少代謝產(chǎn)物的堆積[14]。此外，紅景天苷具有抗自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，能阻斷氧自由基導(dǎo)致的生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及其引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[15]。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究發(fā)現(xiàn)，在 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型中，紅景天苷通過(guò)增強(qiáng)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、延長(zhǎng)小鼠的記憶延遲時(shí)間、促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂及白介素-2 的合成來(lái)逆轉(zhuǎn) D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老作用[16]；而在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)早熟性衰老的人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞中，紅景天苷通過(guò)改變細(xì)胞衰老樣表型、細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子的表達(dá)同樣可以逆轉(zhuǎn)氧化劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的衰老相關(guān)表型[5]。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步利用自然衰老小鼠模型研究了紅景天苷的抗衰老作用，證實(shí)了紅景天苷可以提高自然衰老小鼠體內(nèi)不同器官、組織的 SOD 和GSH-Px 活性，降低自然衰老小鼠各器官、組織中的 LPO 及脂褐素水平；其效應(yīng)在多個(gè)器官、組織中與常用抗衰老藥物人參皂苷類似。由此猜測(cè)，通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶活性、降低體內(nèi)過(guò)氧化物水平而延緩衰老，可能是紅景天苷的主要作用機(jī)制。

綜上，本研究利用自然衰老小鼠模型進(jìn)一步證明了紅景天苷體內(nèi)的抗衰老作用，豐富了紅景天苷抗衰老的機(jī)制，為該藥物在臨床上的可能應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

[1] Ming DS, Hillhouse BJ, Guns ES, et al. Bioactive compounds from Rhodiola rosea (Crassulaceae). Phytother Res, 2005, 19(9):740-743.

[2] Huang SC, Lee FT, Kuo TY, et al. Attenuation of long-term Rhodiola rosea supplementation on exhaustive swimming-evoked oxidative stress in the rat. Chin J Physiol, 2009, 52(5):316-324.

[3] Li F, Tang H, Xiao F, et al. Protective effect of salidroside from Rhodiolae Radix on diabetes-induced oxidative stress in mice.Molecules, 2011, 16(12):9912-9924.

[4] Ma L, Cai DL, Li HX, et al. Protective effects of salidroside on oxidative damage in fatigue mice. J Chin Integr Medicine, 2009, 7(3):237-241. (in Chinese)馬莉, 蔡?hào)|聯(lián), 黎懷星, 等. 紅景天苷對(duì)疲勞小鼠氧化損傷的保護(hù)作用. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào), 2009, 7(3):237-241.

[5] Mao GX, Wang Y, Qiu Q, et al. Salidroside protects human fibroblast cells from premature senescence induced by H(2)O(2) partly through modulating oxidative status. Mech Ageing Dev, 2010, 131(11-12):723-731.

[6] Chen Q. Anti-aging research methodology. Beijing: China Medical Science Press, 1996:608-609. (in Chinese)陳勤. 抗衰老研究實(shí)驗(yàn)方法學(xué). 北京: 中國(guó)醫(yī)藥技術(shù)出版社, 1996:608-609.

[7] Ministry of Health of the People's Republic of China. Inspection and assessment standard for health food. 2003:43-57. (in Chinese)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范. 2003:43-57.

[8] Gao QF, Zhu XY, Wang SS, et al. Research on the pharmacological effects of Kang shuailin. Chin Pharm J, 1994, 29(2):91-94. (in Chinese)高清芳, 朱秀英, 王書(shū)聲, 等. 中藥抗衰靈抗衰老作用的藥理學(xué)研究. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 1994, 29(2):91-94.

[9] Wang Z, Li DD, Liang YY, et al. Activation of astrocytes by advanced glycation end products: cytokines induction and nitric oxide release.Acta Pharmacol Sin, 2002, 23(11):974-980.

[10] Alexeyev MF. Is there more to aging than mitochondrial DNA and reactive oxygen species? FEBS J, 2009, 276(20):5768-5787.

[11] Song X，Bao M, Li D, et al. Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model. Mech Ageing Dev, 1999, 108(3):239-251.

[12] Halliwell B. Reactive oxygen species and the central nervous system.J Neurochem, 1992, 59(5):1609-1623.

[13] Jin YR, Wang L, Sui DY, et al. Antiaging actions of extracta from the stems and leaves of Rhodiola Sachliensis A.Bor (EFSLR). Chin J Gerontol, 2001, 21(3):228-229. (in Chinese)金永日, 王黎, 睢大員, 等. 紅景天莖葉提取物的抗衰老作用研究.中國(guó)老年學(xué)雜志, 2001, 21(3):228-229.

[14] Huang ZY, Fan SD. Study on action mechanism of antifatigue effect of Rhodiola Sachalinesis A.Bor in mouce. J China Med Univ, 1998,27(2):123-125. (in Chinese)黃增艷, 范書(shū)鐸. 庫(kù)頁(yè)紅景天對(duì)鼠抗疲勞作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 27(2):123-125.

[15] Wen J, Guo Y, Chang P. Experimental observation on anti-oxidation of Rhodiola sacra extract. Chin J Clin Rehabil, 2005, 9(11):125-127. (in Chinese)文鏡, 郭豫, 常平. 紅景天提取物抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)觀察. 中醫(yī)康復(fù)研究, 2005, 9(11):125-127.

[16] Mao GX, Deng HB, Yuan LG, et al. Protective role of salidroside against aging in a mouse model induced by D-galactose. Biomed Environ Sci, 2010, 23(2):161-166.