小鼠子宮內(nèi)膜細胞的原代培養(yǎng)與鑒定＊

喬明霞 劉 萍 徐 艷 李允廣

山東省棗莊市婦幼保健院 277102

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，IVF－ET已經(jīng)是治療不孕不育的重要手段，但是臨床的妊娠率仍然不高。一部分原因是由于在胚胎種植窗期，子宮內(nèi)膜由非接受態(tài)轉(zhuǎn)化為接受態(tài)的過程出現(xiàn)了異常。人們對該過程的確切調(diào)控機制知之甚少，而直接在體研究有很大的局限性，因此子宮內(nèi)膜體外培養(yǎng)體系的建立非常重要，對研究子宮的生殖生理具有重要意義。但是小鼠子宮較小，內(nèi)膜組織取材困難，純度不高，導致進一步的培養(yǎng)發(fā)生困難，探討一種操作步驟簡單、細胞損失少、純度高的新的細胞培養(yǎng)技術非常必要。本文介紹一種相對簡捷的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及基質(zhì)細胞原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級昆明種成年雌性小白鼠（煙臺市綠葉制藥有限公司動物中心提供）20只，8～10周齡，體重25～30g。雌雄按2∶1比例合籠，次晨檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓者記做妊娠第1天。

1.2 設備和試劑 （1）主要設備：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma3131）、Olympus倒置顯微鏡（日本）、200目篩網(wǎng)、離心機（Eppendorf5702）、超凈工作臺（青島Haier集團公司）。（2）試劑：DMEM／F12高糖培養(yǎng)液（Hyclone公司）、胎牛血清（FCS，Gibco公司）、膠原酶Ⅰ（Gibco公司）、雙抗（Hyclone公司）、兔抗鼠角蛋白抗體、兔抗鼠波形蛋白抗體、鏈霉素生物素－過氧化物酶（SP）標記的羊抗兔免疫組化試劑盒（均為北京中山金橋生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 妊娠第4天雌鼠斷頸處死，迅速無菌取出子宮，置于含雙抗的DMEM／F12（4℃預冷）的3.5cm培養(yǎng)皿中，去除脂肪后，再次用含雙抗的DMEM／F12培養(yǎng)液沖洗子宮兩遍，取彎折成90°的20ml注射器針頭用擠壓法擠出小鼠子宮內(nèi)膜組織。將子宮內(nèi)膜剪成細顆粒狀組織塊。用2g／ml的膠原酶Ⅰ按3∶1混合，37℃培養(yǎng)箱消化150min。以含血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化，反復吹打后收集培養(yǎng)液，200目濾網(wǎng)過濾將組織棄去。1 000r／min離心10min收集內(nèi)膜細胞沉淀。吸去上清液，加少許含10%FCS的培養(yǎng)液輕輕吹打細胞制成細胞懸液。調(diào)整細胞密度，以1×105／ml的密度接種于6孔培養(yǎng)板（培養(yǎng)板孔內(nèi)放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片），置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況 ，隔日更換細胞培養(yǎng)液。

1.3.2 細胞的免疫化學染色：待細胞生長成單層后取出玻片，預冷的PBS漂洗，4%多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗；3%的H2O2室溫下孵育15min，PBS沖洗；10%的正常羊血清37℃封閉30min；加一抗（波形蛋白抗體、角蛋白抗體）稀釋濃度為1∶200，4℃過夜孵育；二抗（SP標記的羊抗兔IgG）即用型工作液，37℃孵育30min；PBS沖洗，DAB顯色；蘇木精復染；鹽酸酒精分色；中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替一抗，其他步驟相同。高倍鏡下計數(shù)100個細胞，計算細胞陽性率。

2 結果

2.1 形態(tài)學特征 倒置顯微鏡下觀察基質(zhì)細胞平鋪生長呈單個分散細胞，在接種30min貼壁。細胞呈多角形或者梭形。多角形細胞胞漿薄而透明，有多個短小突起。消化后的腺上皮細胞呈管狀或葡萄狀，在接種24h后已貼壁。成團生長，培養(yǎng)2d后腺上皮細胞長成鋪路石樣的單層細胞集落排列緊密，細胞核大而圓，位于細胞中央。

2.2 細胞鑒定及純度檢測 采用對上皮細胞特異的細胞角蛋白18抗體和對基質(zhì)細胞特異的波形蛋白抗體進行免疫細胞化學染色。子宮內(nèi)膜腺上皮細胞角蛋白染色陽性，胞質(zhì)被染成棕色，核呈藍色，陽性率約96%（見圖1，腺上皮細胞角蛋白－18染色陽性）。基質(zhì)細胞波形蛋白染色胞質(zhì)也呈棕色，陽性率達93%（見圖2，基質(zhì)細胞波形蛋白染色陽性）。

3 討論

圖1 腺上皮細胞（×200）

圖2 基質(zhì)細胞（×400）

本研究結果表明，運用擠壓法和酶消化法相結合，可以成功地培養(yǎng)出圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞。用擠壓法［1］可以完整分離出圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜。膠原酶Ⅰ消化作用溫和緩慢，消化后獲得的細胞比胰蛋白酶消化后獲得的細胞活力高。本研究采用二者結合培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜細胞，不但使子宮內(nèi)膜細胞純度提高，而且增加了細胞的活力。子宮內(nèi)膜細胞由單層柱狀腺上皮細胞和固有層基質(zhì)細胞組成，兩者相互作用，相互影響，腺上皮和基質(zhì)細胞均受卵巢激素的影響產(chǎn)生周期性的變化，基質(zhì)細胞具有旁分泌功能，其產(chǎn)生的酶類、功能蛋白和細胞因子調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜腺體細胞的分化、增殖。Kleinman［2］研究表明基質(zhì)是子宮腺上皮細胞生長、分化的必要條件，Arnold［3］提出基質(zhì)細胞可能參與雌激素對上皮細胞的調(diào)節(jié)作用。所以將腺上皮細胞和基質(zhì)細胞共同培養(yǎng)，以發(fā)揮兩者的協(xié)同作用。對進一步研究小鼠子宮內(nèi)膜細胞的生物活性和各種因素的調(diào)節(jié)作用以及建立與胚胎的共培養(yǎng)體系等具有重大意義。

［1］ 譚毅，顧美禮，王智彪，等.完整分離圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜方法的建立〔J〕.中國實驗動物學報，2001，9（1）：40－44.

［2］ Kleinman HK，McGarvey ML，Hassell JR，et al.Basement membrane complexes with biological activity〔J〕.Biochemistry，1986，25：312.

［3］ Arnold JT，Kaufman DG，Seppala M，et al.Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro：a new co－culture model〔J〕.Hum Reprod，2001，16：836.