南京地區產超廣譜β－內酰胺酶菌的流行病學調查

王衛文 李有武 夏永祥 劉才冬

南京醫科大學附屬南京第一醫院檢驗科，江蘇省南京市 210006

超廣譜β－內酰胺酶（extended－spectrumβ－lactamases，ESBLs）是由質粒介導可水解含氧亞氨基的β－內酰胺類抗生素，并可被β－內酰胺酶抑制劑克拉維酸等抑制的一類β－內酰胺酶，主要由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產生。產ESBLs菌不僅對第三代頭孢菌素和氨曲南耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物也有交叉耐藥。根據2001年Bradford的分類，將ESBLs分為TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型及其他型五類［1，2］。為了解南京地區產ESBLs菌的基因型流行情況，筆者收集了南京地區四家三級甲等醫院臨床標本中分離的60株產ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分別用TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型ESBLs的特定引物進行擴增并對擴增產物進行測序分析，得到南京地區產ESBLs菌的基因型流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：30株產ESBLs大腸埃希菌和30株產ESBLs肺炎克雷伯菌分別分離自江蘇省人民醫院、南京市鼓樓醫院、南京市第一醫院和南京市中大醫院臨床標本，所有菌株均經法國生物梅里埃公司ATB Expression自動細菌鑒定儀重新鑒定，并經ESBLs確證試驗確定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 藥敏紙片：頭孢噻肟（30μg／片），頭孢他啶（30μg／片），頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg），頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）以上紙片均為英國Oxoid公司產品。

1.1.3 儀器及試劑：ATB Expression細菌鑒定及藥敏智能系統，細菌鑒定試條、M－H瓊脂均為法國生物梅里埃公司產品。TaqDNA酶、dNTP、PCR純化試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs確證試驗［3］：按照標準紙片擴散法的規定接種M－H平板，在M－H平板上貼上頭孢噻肟（30μg／片），頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg）和頭孢他啶（30μg／片），頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）紙片，35℃孵育16～18h，對兩組中任何一個藥物，在加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑相比增大值≥5mm時，判定為產ESBLs菌。

1.2.2 PCR擴增：PCR擴增用煮沸法提取細菌DNA，取2μL用于PCR擴增。反應參數：94℃1min，56℃1min，72℃1min，循環30次，最后72℃延伸10min。引物設計如下：TEM型5’－TCGGGGAAATGTGCG－3’（1－15），5’－TGCTTAATCAGTGAGGCACC－3’（953－972）；SHV型5’－GCCTTTATCGGCCTTCACTCAAG－3’（37－59），5’－TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA－3’（912－934）；CTX－M型CTX－M－1組5’－GGCCCATGGTTAAAAAATCCTGC－3’（60－81，5’加GG），5’－CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG－3’（926－950）；CTX－M－2組5’－CTCAGAGCATTCGCCGCTCA－3’（13－32），5’－CCGCCGCAGCCAGAATATCC－3’（836－855）；CTX－M－8組5’－ACTTCAGCCACACGGATTCA－3’（237－256），5’－AAGTGGAGCGACAGAGC－3’（1168－1184）；CTX－M－9組5’－GTCACAGCCCTTCGGC－GAT－GATTC－3’（854－876，5’加G），5’－GCGCATGGTGACAAAGAGA－GTGCAA－3’（1－21，5’加GCGC）；OXA型OXA－2組5’－GGAGCAGCAACGATGTTACG－3’（54－73），5’－GGCGGTAACGCTTCAATAGA－3’（896－915）；OXA－10組5’－CCACCAAGAAGGTGCCATGA－3’（106－125），5’－GCGACCTTGAGCGACTTGTT－3’（921－940）。

1.2.3 PCR產物克隆測序：PCR產物純化后與pGEM－T載體連接，轉化入大腸埃希氏菌DH5α后，經含氨芐西林的麥康凱培養基篩選陽性克隆白斑，堿法抽提質粒DNA，EcoRI酶切分析鑒定插入片段，并對質粒DNA進行序列分析，將所測序列與GeneBank頒布的序列進行比對，確定基因型。

2 結果

2.1 表型確證試驗 30株產ESBLs大腸埃希菌和30株產ESBLs肺炎克雷伯菌在ESBLs確證試驗中對頭孢噻肟和頭孢他啶加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑相比增大值≥5mm情況見表1。

表1 60株產ESBLs菌表型確證試驗結果（單位：株）

2.2 基因型分布 60株產ESBLs菌株CTX－M－2組、CTX－M－8組、OXA－2組及OXA－10組PCR擴增未發現陽性標本。39株TEM型PCR擴增陽性，序列分析證實均為TEM－1型廣譜酶。CTX－M－1組擴增陽性有16株，為13株CTX－M－3、3株CTX－M－15。CTX－M－9組擴增陽性有37株，為32株CTXM－14、5株CTX－M－24。SHV型PCR擴增陽性有8株：6株為SHV－1、1株為SHV－11、1株為SHV－28，SHV－11與SHV－1相比僅在35位上由谷氨酰胺取代亮氨酸，這些位點的改變不影響酶活性和酶的底物范圍，所以SHV－11和SHV－1不是ESBLs［1］，SHV－28也為廣譜酶［4］。有9株未擴增到ESBLs基因型，它們的具體基因型有待進一步研究。詳細的基因型分布見表2。

表2 ESBLs基因型分布

3 討論

不同地區由于抗生素使用的種類不同，造成ESBLs流行的基因型也不盡相同。歐洲國家主要以TEM型和SHV型為主，我國主要以CTX－M型流行為主［5，6］，這與我國頭孢噻肟的大量使用有著密切的關系，而歐洲國家頭孢他啶使用得更普遍一些。本次調查對南京地區產ESBLs菌TEM型、SHV型、CTX－M型及OXA型基因型進行了一次較為全面的檢測，發現南京地區ESBLs基因型以CTX－M型為主，主要為CTX－M－3、CTX－M－14，OXA型未擴增到陽性，TEM型、SHV型PCR擴增陽性產物經測序為TEM－1、SHV－1、SHV－11和SHV－28，它們都屬于廣譜酶。CTX－M型ESBLs對頭孢噻肟水解能力較強，而對頭孢他啶的水解能力很弱。從表型確證試驗的結果也能看出：60株菌中41株菌表現為僅頭孢噻肟組陽性。本次試驗有9株菌PCR擴增陰性，說明本地區可能存在上述引物無法擴增出的其他ESBLs基因型。

現在世界各地不斷有新的ESBLs基因型報道，隨著抗生素的大量使用還會有更多的基因型出現，因為不同的基因型水解的底物不同，因此及時、準確的了解本地區的基因型流行情況，對指導臨床合理使用抗生素有著重要的意義，以達到控制耐藥菌株的蔓延。

［1］ 俞云松.超廣譜內酰胺酶研究概況〔J〕.中國抗生素雜志，2003，28（12）：712－717.

［2］ 俞云松.細菌β－內酰胺酶檢測的臨床意義〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2008，31（6）：475－477.

［3］ National committee for clinical laboratory standards.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing〔S〕.M100－S18.NCCLS，2008.

［4］ 俞云松，陳亞崗，周偉琳，等.一種新基因型SHV－28β－內酰胺酶的發現及其特性的初步研究〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2001，24（4）：204－206.

［5］ 孫景勇，倪語星.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β－內酰胺酶的基因分型〔J〕.中國抗感染化療雜志，2002，2（4）：211－214.

［6］ 季淑娟，顧怡明，譚文濤，等.中國部分地區大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β－內酰胺酶基因型研究〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2004，27（9）：590－593.