陽和湯體外對大鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞增殖的影響*

黃立中 王云丹 田 莎 伍參榮 彭吉勇 毛 丹 呂 宇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.湖南省長沙市中醫(yī)院，湖南 長沙 410100）

骨轉(zhuǎn)移癌最常見的表現(xiàn)為進(jìn)行性骨痛、病理性骨折。為探討陽和湯抗骨轉(zhuǎn)移癌的作用機(jī)制，筆者通過體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞及體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞體系，研究含藥血清對大鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 2 d齡SD大鼠 （分離成骨細(xì)胞用），3月齡的SD大鼠 20只（制備載藥血清用），體質(zhì)量（200±50）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 藥物 陽和湯由鹿角膠、肉桂、白芥子、熟地黃、麻黃、姜炭、生甘草組成，經(jīng)水煎醇沉后濃縮而得實驗用藥，生藥含量為1.5 g/mL。藥材購置于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.3 試藥與儀器 胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS），5 mg/mL 四甲基偶氮唑鹽 MTT （Sigma）， 二甲基亞砜（DMSO 分析純），DMEM 培養(yǎng)液（GBICO），區(qū)拉同 X-100（上海瑞金生物公司），對硝基苯酚（上海瑞金生物公司），M-CSF（Sigma公司），RANK-L（Sigma公司）。低速離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表公司），水浴箱（上海精宏實驗設(shè)備公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司），CO2培養(yǎng)箱（2300 型，USA），倒置顯微鏡（南京江南光電公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（Austria）。

1.4 陽和湯含藥血清制備 20只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組（給予蒸餾水灌胃），陽和湯高劑量組 12 g/（kg·d）、中劑量組 4 g/（kg·d）低劑量組 1.3 g/（kg·d），每組 5 只。 各組連續(xù)7 d灌胃給藥，末次給藥2 h后，予巴比妥鈉麻醉大鼠，行腹主動脈采血，分離血清，56℃滅活30 min，用0.22 μm過濾除菌，分裝標(biāo)記后置4℃冰箱備用。

1.5 大鼠成骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)［1］取2 d齡SD乳大鼠，在無菌條件下，分離顱頂蓋骨，剔除骨膜及其他組織，用D-Hank’s液沖洗3次，用眼科剪將骨片剪成1 mm×1 mm的碎塊，加入0.25%的胰蛋白酶，于37℃消化30 min，棄上清液，D-Hank’s沖洗3次，加入含0.05%胰蛋白酶及2 mg/mL的Ⅰ型膠原酶的消化液，37℃消化2 h，吸取消化液，經(jīng)140目尼龍網(wǎng)過濾，再用DMEM培養(yǎng)液沖洗消化的骨殘集，收集沖洗液，過濾后與消化液混合，以1500 r/min離心15 min，收集細(xì)胞，即為新鮮的成骨細(xì)胞，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整密度為1×105細(xì)胞/mL，接種于100 mL的培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。24 h后換液。以后視細(xì)胞生長情況2～3 d換液1次。

1.6 大鼠破骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)［2］取2 d齡SD乳大鼠5只，無菌取四肢長骨，放入含青、鏈霉素的冷D-Hank’S平衡鹽溶液中，小心剝離肌肉組織，將軟組織去除干凈，洗2～3次，并將干骺段剪去，然后將骨置于5 mL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，先橫向剪成4～5 mm長的骨段，再縱向剪開暴露骨干內(nèi)側(cè)，用吸管反復(fù)吹打5～10 min，使貼附在骨基質(zhì)上的破骨細(xì)胞脫落下來，收集含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液，于35 mm培養(yǎng)皿中靜置10 min，收集未貼壁的細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，以1000r/min離心10min，棄去上清液，所得白色沉淀物即為制得的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打均勻，將細(xì)胞懸液通過200目細(xì)胞篩，去除可能存在的非破骨細(xì)胞和雜質(zhì)成分。然后將濾過后的細(xì)懸液調(diào)成1×106/mL濃度，吹打均勻后，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。12 h后換液，以去除紅細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，每2日換液1次，生物倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。

1.7 MTT測定［3］藥物對細(xì)胞增殖的影響：原代成骨細(xì)胞（細(xì)胞傳至第3代用于實驗）、成骨細(xì)胞株UMR106和破骨前體細(xì)胞RAW264.7分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（1×105個/mL），每個培養(yǎng)板分為 5 組，每組設(shè) 6 復(fù)孔，置 37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁后，用D-Hank’s洗滌3次，進(jìn)行隨機(jī)分為空白血清組：加不含藥大鼠血清50 μL+20%DMEM 100 μL；陽和湯含藥血清高劑量組：加陽和湯高劑量血清50 μL+20%DMEM 100 μL；陽和湯含藥血清中劑量組：加陽和湯中劑量血清50 μL+20%DMEM100 μL；陽和湯含藥血清低劑量組：加陽和湯低劑量血清50 μL+20%DMEM100 μL；陰性細(xì)胞對照組：為不加藥，不加大鼠血清的常規(guī)培養(yǎng)陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，凋零孔加PBS液，并于結(jié)束培養(yǎng)前4 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄培養(yǎng)液，再在每孔加入150 μL DMSO，充分震蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測各孔吸光度值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）＝實驗組 A490/正常對照組 A490×100%。

1.8 破骨前體細(xì)胞形態(tài)觀察及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性測定［4］RAW264.7接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（1×105個/mL）。 各孔 RAW264.7細(xì)胞加誘導(dǎo)體系（M-CSF 和RANK-L）的同時分別加入不同濃度的陽和湯含藥血清和空白血清各10 μL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞每3日換液1次，同時設(shè)不加血清藥只加誘導(dǎo)體系的空白對照。第4日開始對只加誘導(dǎo)體系的空白對照細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色，生物光鏡觀察破骨細(xì)胞形態(tài)。另一部分培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)第4日，第5日，第6日，分別測定TRAP酶活測定。其操作過程為：首先PBS沖洗細(xì)胞2次，加入20 μL，0.1%的區(qū)拉通5 min以裂解細(xì)胞，取上清，隨后加入反應(yīng)液50 μL（稱取對硝基苯酚磷酸二鈉0.4 g，加入酒石酸甲鈉2.0 g，用 1 mol/L 的 HCl調(diào) pH3.5，至終體積為 200 mL），37℃反應(yīng)30 min，迅速加入1 mol/L的NaOH 100 μL終止反應(yīng)。于530 nm處測其吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線為不同濃度的對硝基苯酚溶液在530nm處的吸收值與濃度所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每孔生成的對硝基苯酚的摩爾數(shù)表示TRAP活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陽和湯含藥血清對原代成骨細(xì)胞及UMR106細(xì)胞增殖的影響 見表1～表2。除了低劑量、24 h時間點外，各濃度各時間點吸光度均有顯著上升；對UMR106細(xì)胞株增殖影響情況與原代細(xì)胞類似。各含藥血清組與空白對照組同時間內(nèi)比較、或同組不同時間內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），含藥血清對原代成骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞株UMR106的增殖具有顯著促進(jìn)作用。

表1 各組原代成骨細(xì)胞增殖率比較（n＝6，±s）

表1 各組原代成骨細(xì)胞增殖率比較（n＝6，±s）

與空白血清組比較，*P＜0.05。下同。

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.31±0.01 100.00±0.00 0.50±0.02 100.00±0.00 0.63±0.03 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.32±0.01 103.13±0.08 0.54±0.02 109.02±0.07* 0.71±0.04 113.12±0.05*陽和湯含藥血清中劑量組 0.34±0.01 110.04±0.09* 0.59±0.03 119.05±0.07* 0.71±0.04 113.30±0.07*陽和湯含藥血清高劑量組 0.34±0.02 110.12±0.10* 0.62±0.04 123.79±0.09* 0.74±0.04 118.41±0.04*組別

2.2 陽和湯含藥血清對原代破骨細(xì)胞分化能力的影響 破骨前體細(xì)胞形態(tài)破骨細(xì)胞增殖和分化能力是影響其骨吸收的重要方面，在生物倒置顯微鏡顯微鏡鏡下：原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)第4日出現(xiàn)偽足，核大圓；第5日細(xì)胞多角形，核1個；培養(yǎng)第6日破骨細(xì)胞形態(tài)呈花瓣狀，可見2～3核（見圖1）。

表2 各組UMR106成骨細(xì)胞增殖率比較（n=6，±s）

表2 各組UMR106成骨細(xì)胞增殖率比較（n=6，±s）

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.32±0.01 100.00±0.00 0.49±0.03 100.00±0.00 0.66±0.02 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.33±0.01 103.11±0.05 0.55±0.01 112.42±0.05* 0.72±0.02 109.21±0.06*陽和湯含藥血清中劑量組 0.35±0.01 109.47±0.05* 0.57±0.02 117.16±0.07* 0.76±0.01 115.37±0.05*陽和湯含藥血清高劑量組 0.37±0.02 116.62±0.08* 0.62±0.02 126.49±0.08* 0.81±0.04 122.70±0.08*組別

圖1 原代破骨細(xì)胞生長形態(tài)觀察（40×10）

利用TRAP染色觀察藥物對破骨前體細(xì)胞增殖和分化能力的影響，結(jié)果可見空白血清組細(xì)胞增殖、分裂活躍；陽和湯含藥血清高劑量組破骨核分化能力降低，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；陽和湯含藥血清中劑量組破骨核分化能力降低，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹；陽和湯含藥血清低劑量組破骨胞形成弱低于空白血清組，如圖2。

圖2 （40×10）

2.3 陽和湯含藥血清對破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 見表3。陽和湯含藥血清低劑量組破骨前體細(xì)胞RAW264.7增殖率與空白組比較24、48、72 h差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；陽和湯含藥血清中、高劑量組破骨前體細(xì)胞RAW264.7增殖率均低于空白血清組，24、48、72 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），提示陽和湯抑制破骨細(xì)胞的增殖有劑量-效應(yīng)。

表3 各組RAW264.7細(xì)胞增殖率比較（n=6，±s）

表3 各組RAW264.7細(xì)胞增殖率比較（n=6，±s）

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.31±0.01 100.00±0.00 0.49±0.03 100.00±0.00 0.66±0.02 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.31±0.01 100.11±0.05 0.48±0.04 97.59±0.12 0.65±0.01 97.24±0.03陽和湯含藥血清中劑量組 0.30±0.01 96.77±0.05* 0.47±0.03 95.91±0.09* 0.64±0.03 95.97±0.08*陽和湯含藥血清高劑量組 0.30±0.01 95.72±0.05* 0.46±0.02 92.39±0.07* 0.64±0.01 95.90±0.05*組別

2.4 陽和湯含藥血清對破骨前體細(xì)胞TRAP活性的影響 見表4。由表4知，與空白血清組相比，陽和湯含藥血清各劑量組24 h TRAP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；陽和湯含藥血清低劑量組對破骨細(xì)胞的TRAP活性24、48 h影響不大，與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），但72 h TRAP活性低于空白血清組（P＜0.05）；陽和湯含藥血清中劑量組、高劑量組48、72 h破骨細(xì)胞TRAP活性均明顯低于空白血清組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組破骨細(xì)胞 TRAP活性比較（n=6，μ/L，±s）

表4 各組破骨細(xì)胞 TRAP活性比較（n=6，μ/L，±s）

組 別 24 h 48 h 72 h空白血清組 27.21±1.26 38.01±2.24 40.47±2.80陽和湯含藥血清低劑量組 27.20±1.41 37.90±1.58 38.80±2.85*陽和湯含藥血清中劑量組 26.71±1.92 35.81±1.87* 36.61±1.64*陽和湯含藥血清高劑量組 26.83±1.73 34.99±1.75* 35.46±2.42*

3 討 論

正常骨代謝過程是一種骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡過程，這一過程受到體內(nèi)外許多因素的調(diào)控，任何不良因素均會導(dǎo)致骨代謝受阻。正常的骨代謝是通過成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，在這個過程中，大量的相關(guān)因子參與其中，成為骨微環(huán)境主要部分。研究表明，大部分乳腺癌患者的骨轉(zhuǎn)移為溶骨性轉(zhuǎn)移，約15%～20%的患者同時有成骨性特征［5］。溶骨性轉(zhuǎn)移中，骨的破壞主要是由破骨細(xì)胞引起的，腫瘤細(xì)胞的主要作用是分泌一系列因子來啟動和生成破骨細(xì)胞而溶骨。在體內(nèi)骨微環(huán)境系統(tǒng)中，如果成骨細(xì)胞數(shù)目的增長到達(dá)一定比例，使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子，從而對破骨細(xì)胞的形成分化產(chǎn)生抑制作用。因此，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)骨形成和骨吸收之間出現(xiàn)正平衡，成為抗骨質(zhì)破壞的重要治療機(jī)制［6］。

陽和湯源于王洪緒《外科證治全生集》，原方用于治療陰疽。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨轉(zhuǎn)移癌局部腫塊堅硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變等臨床特征，與“寒主收引、主凝滯、主痛”等中醫(yī)理論相符，屬陰寒證。黃立中教授在臨床用陽和湯加味治療骨轉(zhuǎn)移癌取得了明顯的療效［7］，王氏［8］用陽和湯加味合云克治療骨轉(zhuǎn)移癌 30例。施氏［9］用陽和湯合帕米磷酸二鈉（博林針）治療惡性腫瘤31例也取得一定療效。本實驗采用中藥血清藥理學(xué)方法，探討了陽和湯對成骨細(xì)胞增殖的影響作用；對破骨前體細(xì)胞增殖、分化以及TRAP活性的影響。研究結(jié)果表明：陽和湯含藥血清不僅可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，同時，可抑制破骨前體細(xì)胞增殖，降低破骨前體細(xì)胞TRAP活性，提示陽和湯含藥血清抑制破骨前體細(xì)胞增殖，降低破骨前體細(xì)胞TRAP活性，對成骨細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用。這可能是陽和湯抗骨轉(zhuǎn)移癌的重要作用機(jī)制，為陽和湯抗骨轉(zhuǎn)移癌的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

［1］劉祖德，臧鴻聲，歐陽躍平.新生大顱蓋骨體外生長過程的研究［J］.解剖學(xué)報，1995，26（2）：157-159.

［2］陳長華，方泰惠，周玲玲.清絡(luò)通痹顆粒含藥血清對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響［J］.中成藥，2008，30（1）：35-38.

［3］邊興艷.MTT比色法及其應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，1998，19（2）：83-85.

［4］Yan GM，Lin SZ，Irwin RP，et al.Activation of muscarinic cholinergic receptors blocks apoptosis of cultured cerebellar granule neurons［J］.Molecular Pharmacology，1995，47：248-257.

［5］Coleman RE，Seaman JJ.The role of zoledronic acid in cancer：clinical studies in the treatment and prevention of bone metastases［J］.Semin Oncol，2001，28（Supll）：11-16.

［6］匡梨，謝正強(qiáng).唑來磷酸治療骨轉(zhuǎn)移癌的機(jī)制研究［J］.中國腫瘤臨床，2009，36（6）：678-679.

［7］黃立中，蔣益蘭，曾松林，等.陽和湯加味治療骨轉(zhuǎn)移癌疼痛63例［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，11（1）：20-21.

［8］王云啟.陽和湯加味合云克治療骨轉(zhuǎn)移癌30例臨床觀察［J］.浙江中醫(yī)藥雜志，2005，1（17）：17.

［9］施航.陽和湯和帕米磷酸二鈉治療惡性腫瘤骨痛觀察［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2005，21（6）：359.