柑橘內生菌的研究進展

胡秀榮黃振東蒲占湑杜丹超鹿連明陳國慶

（浙江省柑橘研究所臺州黃巖318020）

柑橘內生菌的研究進展

胡秀榮黃振東蒲占湑杜丹超鹿連明陳國慶

（浙江省柑橘研究所臺州黃巖318020）

植物內生菌是指生活于健康植物組織內部不引發植物明顯病癥的微生物，但在植物衰老或外界刺激條件下，植物自身免疫力下降，也可能出現某些病癥；植物內生菌主要包括真菌、細菌和放線菌等[1]。本文主要綜述了柑橘內生菌的最新研究進展，包括內生菌的分離方法、種類及生物防治方面的應用進展情況。

1 柑橘內生細菌

1.1 植物內生細菌一般分離方法

由于內生菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實等器官的組織中，所以分離時可以采集健康的植株，然后對樣品進行一系列的表面消毒，其中包括酒精、次氯酸鈉、高錳酸鉀、升汞等消毒劑進行表面消毒，最后用無菌水沖洗干凈，將消毒好樣品進行無菌研磨，加入少量無菌水，吸取汁液涂平板，待長出細菌后，進行轉接純化，最后一次沖洗水涂板檢測表面消毒是否徹底。此外消毒劑選擇和消毒的時間應根據樣品的軟硬程度確定[1]，Samish等曾對不用消毒技術進行比較，并形成標準化程序[2]。

1.2 柑橘內生細菌的研究應用

柑橘內生細菌的研究主要集中于柑橘內生細菌分離及對柑橘炭疽病、潰瘍病和油菜菌核病等幾種病害的拮抗作用研究。如羅永蘭，張志元等[3]從溫州蜜柑、甜橙、玉環柚三個品種采集支根、主干皮層、一年生枝條、葉片、果實 5種器官作為分離材料進行內生細菌分離，結果分離出75份內生細菌，分別屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonasspp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonasspp.)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)、乳桿菌屬( Lactabacillussp.)，同時發現內生細菌在不同品種和不同器官中出現的頻率不同。羅永蘭等[4]對柑橘拮抗內生細菌生物學特性和抗菌產物的熱穩定性也進行了相關研究。2004年冉國華等[5]研究了柑橘內生拮抗細菌發酵液對油菜菌核病的田間防治效果，發現兩株內生細菌對抑制油菜菌核病病斑擴大有一定效果,但效價不是很高,有必要作進一步的基礎研究。余建等[6]研究了柑橘內生拮抗細菌在油菜上的定殖及對油菜菌核病防效，發現拮抗內生細菌對菌核病有較好的抑制效果，并可以從根部進入油菜植株內定殖，屬于較為理想的生防菌。2005年袁紅旭等[7]從不同品種柑橘果實中分離出16株內生細菌，從中篩選出 4株對柑橘炭疽病有較好防治作用的拮抗內生細菌，其中 1株具有顯著促進柚苗生長作用，但沒有闡明所分離到內生細菌的分類地位。2005年譚小艷等[8]從中國南寧柑橘葉片中分離到對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的細菌菌株，鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），同時該菌對其他作物病害的防治也有潛在的應用價值。

2 柑橘內生真菌

2.1 植物內生真菌的分離方法

內生真菌的分離同樣要經過嚴格的表面消毒，去除表面附生菌及環境中的真菌和細菌，保證分離到的菌為內生菌。分離內生真菌的培養基多為常用真菌培養基，如馬鈴薯葡萄糖培養基、察氏培養基、玉米粉培養基等。內生真菌分離過程用于表面消毒劑主要有乙醇、升汞、次氯酸鈉、甲醛等。何佳等[9]報道采用乙醇浸泡，次氯酸鈉浸泡，無菌水漂洗更適合內生真菌的分離，因為次氯酸鈉具有較好的揮發性，且毒性較小，即使有少量次氯酸鈉浸入植物組織中，也會在平板的培養過程中從植物組織中揮發出來，而且滅菌后用于培養的植物材料剪去了兩頭褐變氧化部分，所以，次氯酸鈉不易殘留在植物組織內影響內生真菌從植物材料中長出。

2.2 柑橘內生真菌的研究應用

根據文獻記錄，柑橘內生真菌有33個屬，內生真菌的分類鑒定主要通過形態觀察，而對不產孢子的內生真菌，運用分子生物學等方法進行鑒定，以發現新的有價值的菌株。國內對柑橘內生真菌的分離也進行了研究，2008年趙昌會等[11]從湖南永州柑橘的枝、葉、果實中分離培養出20株內生真菌，對部分真菌做了分類鑒定，并對內生真菌的拮抗活性進行了初步的研究，發現柑橘內生真菌的代謝產物多數具有抗金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的活性。2005年羅永蘭等[12]從不用地區不同種類上定點多次取樣分離內生真菌，分離到柑橘內生真菌5642株，大部分進行了鑒定，分別屬于24屬，并新發現15屬，柑橘內生真菌表現出豐富的多樣性。目前柑橘內生真菌的研究主要集中于內生真菌的分離與鑒定，而對于柑橘內生真菌的代謝產物的研究還較少，內生真菌除了解其抗菌活性外，還可研究其對病蟲害的防治，對柑橘樹生長、果實產量的影響等，以開發其在生產上的應用價值。

3 柑橘內生放線菌

3.1 植物內生放線菌一般分離方法

先在自來水下沖洗掉樣品表面的泥土，再用超聲波清洗；然后用99%乙醇處理 1min，3%次氯酸鈉處理 5min，最后用99%乙醇再處理30 s。滅菌好的材料用無菌刀切成 1cm× 1cm小塊，置于分離培養基表面。同時，將最后一次處理植物樣品的清洗液涂在ISP 2培養基上，用以檢測表面滅菌的效果。分離培養基置于27℃濕潤的環境中培養 2～ 6周，待放線菌長出[13]。

3.2 柑橘內生放線菌的研究應用

植物內生放線菌是一類新的生防微生物資源，在植物病蟲害的防治中具有很大的應用潛力。內生放線菌作為內生菌的重要類群，是較新的研究領域，從中有可能發現新型活性化合物或提供模板化合物。從目前所研究的植物中分離到的內生放線菌大多為鏈霉菌菌屬（Streptomyces），少部分為稀有放線菌。在植物內生放線菌的應用方面也有很多報道，主要是在農業上病蟲害的防治及在醫藥上抗腫瘤作用的研究等。

相對于柑橘內生細菌和內生真菌，柑橘內生放線菌研究相對較少，有待研究者進行深入研究。

4 展望

植物內生菌是相對未開發的領域，可能擁有豐富的生物多樣性，全世界共有植物接近300000種，而目前所報道的用于內生菌研究的不過幾百種，內生放線菌就更少。由于內生菌在植物體內有穩定的生存空間，且能產生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。內生菌分布于宿主植物組織內部，比暴露于外部環境的附生菌和腐生菌具有更穩定的生存環境，更易于發揮作用，加之，植物內生菌具有一定的宿主專一性，除從其宿主植物吸取養料和對侵染宿主植物的其它生物起作用外，對宿主植物本身及其它生物幾乎沒有影響，而且內生菌可以通過人工接種被導入不同的植物并可以通過植物種子進行遺傳，因此植物內生菌具有作為生物農藥開發的優良特性。目前柑橘內生菌的研究主要集中在內生真菌和內生細菌的研究，而內生放線菌還很少有人研究，由于從內生放線菌中篩選抗生素具有重大意義，因此柑橘內生放線菌應加強相關研究，以篩選具有潛在價值的菌株應用于農業生產。

[ 1]郝曉娟.植物內生菌[M].北京:中國農業科學技術出版社,2010

[ 2]Samish Z，Etinger-TulezynskaR，Bick M.The microflora within the tissue of fruits and vegetables[J].food Sci,1963,28( 3):259～266

[ 3]羅永蘭，張志元，喻珺.柑橘內生細菌的分離與鑒定[J].湖北農業科學,2006,45( 6):773～775

[ 4]羅永蘭,張志元,余建等.柑橘拮抗內生細菌重橘 1號的生物學性狀及其抗菌產物的熱穩定性[J].江西農業學報.2007,19(11):24-26

[ 5]冉國華,張志元.柑橘內生拮抗細菌的發酵液對油菜菌核病的田間防治效果[J].長沙大學學報,2004,18( 4):26～28

[ 6]俞建.柑橘內生細菌YS-45在油菜上的定殖及對菌核病的防效[M].2008

[ 7]袁紅旭,陳勇明等.拮抗炭疽病的柑橘內生細菌的分離與篩選[J].果樹學報,2005,22( 5): 510～513

[ 8]譚小艷,黃思良等.柑橘潰瘍病內生拮抗細菌Bc51的研究[J].植物病理學報,2007,37( 1): 9～17

[ 9]何佳，劉笑潔，趙啟美等.植物內生真菌分離方法的研究[J],食品科學,2009,30(15):139～141

[10]李培，王永斌.植物內生真菌的研究與展望[J].飲料工業,2008,11( 7):11～13

[11]趙昌會，黃芳，丁芳.柑橘內生真菌的分離及抗菌活性的初步研究[J].2005,31( 4):418～421

[12]羅永蘭,張志元,冉國華.柑橘內生真菌的分離與鑒定[J].湖南農業大學學報（自然科學版）.2005,31( 4):418～421

[13]阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統分類[M].北京:科學出版社,2011