骨髓間質干細胞體外誘導分化神經樣細胞功能的研究進展

任瑞芳 綜述 黃良國 審校

遵義醫學院附屬醫院神經內科 遵義 563000

1 體外誘導MSCs分化神經樣細胞的功能

1.1 突觸聯系 神經系統傳導通路發揮正常電生理和分泌神經遞質最基本的解剖結構是神經突觸。Gomes等［4］證實BDNF等神經營養因子可誘導核仁內RNA聚合酶－1（RNA polymerase－1）和細胞外信號調節激酶（ERK）1／2信號通路調控神經元核仁轉錄，并通過細胞外信號調控神經軸突的生長、延長和分支。汪智卿等［5］用IL－1a體外誘導MSCs，突觸素染色陽性有表達神經遞質產生突觸聯系的功能。Cho等［6］利用突觸泡蛋白免疫染色和電生理研究證實，經維甲酸處理的MSCs可產生突觸傳遞表達神經遞質PPT－1基因，表明MSCs分化的神經樣細胞具備可以分泌神經遞質的神經突觸。Yang等［7］單用bFGF就可以有效的誘導BMSC分化為神經樣細胞，并隨神經生長相關蛋白GAP－43的增長此神經樣細胞可以顯示出神經元的特征性電生理現象和高水平的神經細胞標志物。此外該實驗還通過干擾成纖維細胞因子受體（FGFR－1）的RNA和細胞外信號調節激酶（ERK）特異性抑制劑U0126證明BFGF主要通過激活骨髓干細胞中的FGFR－1受體和蛋白激酶－C通路而調節MSCs向神經細胞分化，從而說明了信號傳導通路的可能性。這些研究都證明了誘導后的神經樣細胞具備產生神經功能最基本的神經生理解剖結構，為神經遞質的分泌和正常神經電生理的產生奠定了基礎。

1.2 神經遞質 神經細胞的主要特征是能合成和釋放神經遞質調控跨越其表面膜的離子流而產生電信號。目前一些實驗發現誘導后的神經樣細胞具備去甲腎上腺素（NE）分泌的功能。Chen等［8］用維甲酸和膠質源性神經營養因子誘導MSCs，并用免疫細胞化學法鑒定、高效液相色譜法動態監測，據NE的濃度與峰面積繪制標準曲線和每1×107個細胞的去甲腎上腺素濃度作為主要觀察指標。結果顯示：MSCs培養14d時神經巢蛋白抗原表達陽性，20d時可見長突起的神經元樣細胞，神經核蛋白也表達陽性。NE與峰面積之比有良好的線性關系，回歸率為92.39%。體外誘導分化的神經樣細胞及培養液中NE隨時間相應增加，對照組則為陰性。具有神經營養作用的γ－氨基丁酸（GABA）是廣泛存在于神經系統的一種神經遞質，可促進神經前提細胞的成熟和遷移［9］。許燕等［10］用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和3，4－二羥基苯甲醚（butylated hydmxy lanisole，BHA）誘導人MSCs。RT－PCR檢測誘導3d后GABA－α2和GABA－α3的mRNA表達陽性，表明人MSCs在一定誘導條件下可表達神經細胞的GABA受體。施雪英等［10］采用三七總皂甙對大鼠MSCs進行體外誘導后GABA也表達陽性，該實驗證實三七總皂甙能促進MSCs向神經細胞的橫向分化并明顯延長分化細胞的存活時間，抑制細胞凋亡基因Bcl－2明顯增加，凋亡基因bax明顯減少。觀察在加入誘導劑三七總皂甙后2 h見細胞質收縮，逐漸有突起形成；5h后多數細胞形成明顯的神經元樣細胞形態，胞體呈圓形，突起較長，雙極或多極形，并在突起末端出現分支，部分相鄰細胞的突起連接成網；8～12h后神經元特異性烯醇化酶有大量陽性表達，乙酰膽堿酯酶和γ－氨基丁酸均表達陽性。

人類的感覺、運動和行為等多種生理效應與廣泛分布于腦組織內的5－羥色胺能神經節及5－羥色胺能神經元所分泌的5－羥色胺作用于不同的受體亞型有關。其可促進膠質細胞分化和髓鞘形成，在皮質發育、突觸形成中起著重要作用［11］，是中樞及外周神經系統的重要神經遞質。陳劍榮等［12］用BDNF和維A酸對MSCs進行培養和誘導，12d時見大而圓的細胞，Nestin抗原陽性；20d可見長突起神經元樣細胞，神經核蛋白（NeuN）檢測陽性。另外14d、20d的神經元樣細胞及培養液均可檢測到5－羥色胺且隨時間增加其濃度也相應增加。

乙酰膽堿促進神經干細胞的增殖和分化［13］，膽堿乙酰轉移酶（chAT）作為膽堿能神經元的標志酶是生成ACh的限速酶，常作為研究膽堿能神經元的標志或估計ACh含量（釋放量）的間接指標。Woodbury等［14］發現骨髓間質干細胞分化的神經細胞是一種定量調控基因的表達而不是簡單的開－關神經基因表達。MSCs不僅分化出中胚層神經細胞的mRNA，還可分化出內胚層和外胚層的基因，其分化的神經樣細胞不僅具備微管蛋白－Ⅲ、神經絲蛋白－M、神經突觸蛋白等特殊標記物的表達還可以分泌酪氨酸羥化酶和乙酰膽堿轉移酶。

1.3 電生理特性 神經細胞的離子電生理對神經細胞發揮正常生理效應起著至關重要的作用。目前對于MSCs分化誘導的神經樣細胞電生理的實驗研究均表明該細胞具備成熟神經細胞的某些電生理特性。楊慧民等［15］用誘導劑（a－MEM，體積分數為20%胎牛血清，10μg／L堿性成纖維細胞生長因子）及誘導培養基（α－MEM，2%DMSD，200μmol／L丁羥茴醚）誘導的神經樣細胞50個中有25個ATP電流（50%）、13個GABA電流（26%）、46個總鉀電流（92%）、46個復極化鉀電流（92%）。充分說明在誘導分化的神經樣細胞上存在功能性離子通道，具備電生理特性。Jiang等［16］用BDNF、BFGF等細胞因子及細胞共培養等方法誘導分化的神經樣細胞可長時間存活且表現出更為成熟的神經元形態。利用膜片鉗記錄出的大量數據，顯示共培養5d后的神經元樣細胞有22%的細胞能激發出可能與鈉離子電壓門控通道有關的峰電位，7～12d時高達80%～100%的細胞具備這種電生理特性，未共培養細胞則無此電生理特性。此特性與正常中腦神經元形態結構和電生理特性極為相似。Kohyama等［17］報道N－5雜胞苷與Noggin可誘導MSCs分化為功能成熟具有電生理特點的神經樣細胞，膜片鉗技術監測到的負相電流提示電壓依賴性鉀通道的存在，且加入乙酰膽堿后細胞出現快速可逆的Ca2＋內流。Noggin誘導后28d細胞外鉀和谷氨酸鹽水平升高，胞漿Ca2＋也迅速可逆性增加。

Mareschi等［18］用多種誘導方案體外誘導MSCs分化的神經樣細胞電生理功能檢測可見兩股與鉀通道相關的延遲整合鉀離子流，這是細胞負性靜息電位以及基本功能活性的維持所必須的。胡琳燕等［19］采用丹參對MSCs進行誘導分化，并利用細胞膜電位特異性的熒光探針DiBAC4（3）標記細胞，該方法可以在不損傷細胞膜的基礎上更精確、更便捷地反應細胞的膜電位變化趨勢。另外共聚焦檢測細胞受高鉀刺激的熒光變化顯示：MSCs在第4次誘導后1h時NF表達率（95.3±1.6）%；5h后在高鉀刺激下發生去極化，胞內熒光強度瞬時增強，而空白對照無反應。蘇平等用銀杏內酯B誘導大鼠MSCs為神經樣細胞，并利用膜片鉗技術檢測細胞內離子通道電流，顯示該神經樣細胞除見鉀電流IK外，還可見外向整流IA，類似神經元對照。說明銀杏內酯B誘導的MSCs，不僅具有神經細胞的形態和免疫特性，還具備神經電生理功能。

2 問題與展望

雖然在MSCs誘導分化為具有正常生理功能的神經細胞方面已經具備了很多實驗證據，但仍有很多問題需待進一步研究：（1）如何有效獲得比較純的MSCs，不同分化階段的MSCs細胞學特點和細胞標志仍然沒有非常特異的標記物；（2）如何更有效提升MSCs向神經細胞誘導分化的成活率分化率；（3）MSCs跨胚層誘導分化神經細胞的機制尚不清楚；（4）誘導分化后神經樣細胞的鑒定及功能檢測還需進一步的研究；（5）神經遞質以及神經遞質受體在MSCs增殖和分化中的信號傳導也需進一步深入研究。

由于MSCs來源廣泛，易于分離培養，并具有潛在多向分化潛能，作為傳統不可再生細胞的種子細胞具有諸多優點，雖然目前還有許多問題尚未破曉，但相信隨著研究的深入，MSCs一定會在未來再生醫學領域展現廣闊的應用前景。

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