急性鼻竇炎大鼠黏膜一氧化氮合酶的組織化學變化

許必芳 袁曉輝 朱天明 曾秀燕 熊大經(jīng)

一氧化氮(NO)在體內(nèi)是一種含自由基的氣體,易擴散、不穩(wěn)定、半衰期極短,僅為數(shù)秒;而在大氣中則是有害的化學物質(zhì),但近年來許多研究表明極少量可調(diào)控的NO卻充當生理和病理調(diào)節(jié)介質(zhì),是一種新型的細胞內(nèi)信使分子和效應分子,廣泛參與機體循環(huán),呼吸,消化和神經(jīng)等各個系統(tǒng)的生理和病理調(diào)節(jié),在炎癥和免疫反應中發(fā)揮著重要作用[1]。

1 材料與方法

1.1動物SD大鼠90只,一級動物,體重150～200g,青年,雌雄各半,華西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:川實動管第70號。

1.2藥品與菌株

鼻淵舒口服液實驗制劑:成都中醫(yī)藥大學華神集團生產(chǎn)。青霉素V鉀片:長春市新安制藥廠生產(chǎn),批號:133589。稀化粘素(吉諾通膠囊):德國保時佳大藥廠生產(chǎn),進口注冊證號:X980578。鹽酸氯安酮注射液:上海第一制藥廠生產(chǎn),批號:980701。鹽酸利多卡因注射液:北京萬輝藥業(yè)集團生產(chǎn)。批號:京衛(wèi)藥準字(1998)第104094號。腎上腺素:上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),批號:01004。金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC):四川省衛(wèi)生干部學院微生物教研室研究制備,批號:25935。

1.3器械

骨穿針:6號,天津市醫(yī)用儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。高倍顯微鏡:OLYMPUS AX80型,日本生產(chǎn)。

1.4造模與分組

將大鼠按體重、性別隨機分為九組,每組十只。分別為空白組、模型組、假模型組、鼻淵舒口服液低劑量組、鼻淵舒口服液中劑量組、鼻淵舒口服液高劑量組、西藥1組、西藥2組、中藥+西藥組。其中空白組不做任何處理,假模型組為給大鼠雙側(cè)上頜竇分別注入0.1ml生理鹽水,其余組別為給大鼠雙側(cè)上頜竇分別注入0.1ml金黃色葡萄球菌混懸液(109CFU)。造模7天后開始給藥,給藥時間為7天。給藥方法為鼻淵舒口服液低劑量組:每日以臨床成人劑量5倍的鼻淵舒口服液(濃度為0.81925g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻淵舒口服液中劑量組:每日以臨床成人劑量10倍的鼻淵舒口服液(濃度為1.63185g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻淵舒口服液高劑量組:每日以臨床成人劑量20倍的鼻淵舒口服液(濃度為3.2637g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。西藥1組:每日以臨床成人劑量5倍的青霉素V鉀制成混懸液(含藥量相當于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。西藥2組:每日以臨床成人劑量5倍的稀化粘素制成混懸液(含藥量相當于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。中藥+西藥組:每日以臨床成人劑量5倍的鼻淵舒口服液(濃度為0.81925g/ml)2～3ml和含藥量相當于10mg/kg.d的青霉素與稀化粘素灌胃,分早晚二次灌服。模型組,假模型組:每日以與用藥組等容的生理鹽水灌胃。空白組:正常喂養(yǎng),不灌胃。

1.5標本采集與切片制備

用藥7天結(jié)束后,對實驗動物進行輪流處死,并立即取其鼻黏膜,放4℃冰箱保存,待所有組織取完后,用多組織合包方法[2]進行組織處理,并浸入-170℃液氮內(nèi)保存,經(jīng)-15℃恒冷切片機連續(xù)切片,片厚10u,吹干后冷丙酮(4℃)固定5分鐘,作NADPHD標準脫氫酶組化染色[3]。染色強度采用目測半定量法觀察[4]。即細胞質(zhì)呈深藍色為強陽性反應,藍色為陽性反應,淺藍色為弱陽性反應,著色與背景相同為陰性反應。

2 結(jié)果

鼻黏膜經(jīng)NADPH-脫氫酶染色后,不均等分布于漿液腺、黏液腺細胞質(zhì),粘膜上皮及少許血管內(nèi)皮細胞質(zhì)。空白組、假模型組、鼻淵舒中劑量組鼻黏膜染色為淺藍色,采用目測半定量法定為弱陽性;鼻淵舒低、高劑量組,西藥1組染色都比空白組顏色深,比模型組顏色淺,采用目測半定量法定為陽性,且其顏色依次加深;西藥2組,中藥+西藥組的染色與模型組的顏色非常接近,比空白組顏色深,采用目測半定量法定為強陽性。

3 討論

1980年,Furchgott等用兔胸主動脈實驗時偶然發(fā)現(xiàn)乙酰膽鹼的舒血管反應需依賴于血管內(nèi)皮細胞的存在,才能作用于毒覃鹼樣受體發(fā)揮效應,并在隨后的研究中,把誘導血管松弛的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的介質(zhì)命名為內(nèi)皮細胞舒血管因子(EDRF)[5]。1986年,Furchgott和Ignarro分別提出EDRF就是一氧化氮(NO),1987年,Palmer等用化學發(fā)光法證明內(nèi)皮細胞可以產(chǎn)生NO,并證實EDRF就是NO。其作用機理是NO生成后可使鳥苷酸環(huán)化酶生成cGMP(環(huán)鳥苷酸環(huán)化酶),cGMP作為第二信使參與上述各種作用,NO作用后與血紅蛋白結(jié)合為高鐵血紅蛋白,代謝排出。

NOS廣泛分布于人體多種細胞、組織和器官。鼻黏膜的神經(jīng)支配來源于翼腭神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)。Hanazawa等于1993年首先用尼克酰氨腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)-黃遞酶組織化學染色法測定大鼠鼻黏膜,發(fā)現(xiàn)其免疫陽性纖維圍繞血管、腺體和上皮下層周圍,翼腭神經(jīng)節(jié)的許多神經(jīng)元被標記,三叉神經(jīng)節(jié)的少量神經(jīng)元亦被染色,頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元陰性,說明NOS免疫陽性纖維主要起源于翼腭神經(jīng)節(jié)[6]。Hanzawa等于1997年又用NADPH-黃遞酶組織化學染色法證明人鼻黏膜的陽性纖維分布在血管和黏膜下腺體周圍,翼腭神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元亦為陽性[4]。iNOS位于鼻竇炎患者的表層上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和炎癥細胞,輕微炎癥的標本顯示了在表層上皮細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和鼻腔腺體上的集中染色,在炎癥程度和在表層上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、腺體上的iNOS免疫反應之間有明顯相關(guān)性。

急性鼻竇炎的病理特點是黏膜水腫,炎性細胞浸潤,上皮細胞增殖。它作為一個炎性組織的代表,上皮細胞應答炎癥反應,而誘發(fā)iNOS的大量表達,以及由此導致NO的大量釋放,引起一系列的血管反應。給藥后,減少了大鼠鼻部的炎癥反應,減輕了鼻竇、鼻腔的缺氧狀況,從而使NOS的表達降低。在炎癥的發(fā)展過程中,自始至終都有炎癥介質(zhì)的釋放。NO是呼吸道的重要炎癥介質(zhì),上呼吸道的上皮組織是NO產(chǎn)生的源泉。針對NOS,我們推測鼻淵舒口服液治療大鼠實驗性急性鼻竇炎的作用機理可能是:鼻淵舒口服液降低急性實驗性鼻竇炎大鼠鼻黏膜中NOS的酶活性,抑制炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生和釋放,從而減輕炎癥反應,促進急性鼻竇炎的康復。

[1] 鐘慈聲.孫安陽 一氧化氮的生物醫(yī)學[M].上海:上海醫(yī)科大學出版社,1997.

[2] 李瓊英.多組織合包技術(shù)在毒理實驗酶組織化學中的應用.四川醫(yī)學會衛(wèi)生學會第11界毒理學學術(shù)討論會會議交流資料,1985:118-119

[3] Lojda Z[J].Histochemistry,1979,59:153-159

[4] 黃登清,等.兔急性上頜竇鼻黏膜一氧化氮合酶的組織化學變化[J].福建醫(yī)科大學學報,2002,36(1):52-53

[5] 汪顯陽.一氧化氮合酶抑制劑的研究進展[J].海峽藥學,2001,13(4):1-5

[6] Hanazawa TH,et al[J].Neurosci Lett,1993;159:71-74.