植物類甜蛋白基因家族研究進展

姜曉玲，黃秋嫻，李 虹，趙嘉平

(1.河北農業大學 林學院，河北 保定 071001；2.中國林業科學研究院 林業研究所，北京 100091；3.北京林業大學 林學院 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京100083)

病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)由植物PRs基因編碼，最早從煙草Nicotiana tabacum花葉病毒(tobacco mosaic viru，TMV)侵染的煙草葉片中發現，依據氨基酸組成、生物化學和血清學特性，將PRs分為17個不同的蛋白家族，即PR-1～PR-17[1]。由于 PR-5蛋白家族的氨基酸序列與西非灌Thaumatococcus daniellii甜蛋白(thaumatin)的氨基酸序列高度同源，因此又被稱為類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)[2]。研究表明:TLPs與植物的抗逆反應有關，當植物受到病原物(真菌、細菌、病毒等)，化學因子(乙烯、水楊酸、氨基酸衍生物、重金屬離子等)，物理因子(紫外線、熱處理、機械損傷等)以及特定的生理因素 (衰老、開花、質壁分離等)誘導時，TLPs基因在植物體特定部位迅速表達并積累。許多研究發現植物TLPs具有顯著的抗真菌活性，一些轉TLPs基因的植物對于真菌性病害的抗性也顯著增強[3]，因而近年來，TLPs的抗真菌功能在植物病理學研究中受到越來越廣泛的關注。作為具有較高利用價值的潛在遺傳資源，TLPs基因也在植物抗病育種中展現出了廣闊的應用前景。筆者將從TLPs基因的起源分布、結構特征、表達特征和 TLPs的生理功能出發，分析TLPs基因的研究前景及在植物抗病育種中的應用趨勢。

1 類甜蛋白(TLPs)基因的分布、起源及進化特征

TLPs分布廣泛，不但存在被子植物、裸子植物和苔蘚植物中，而且存在于線蟲[4]、節肢動物[5－6]以及真菌[7－8]中。在植物中，TLPs 分布于不同的細胞或組織中。Léon-Kloosterziel等[9]發現在無致病性假單胞桿菌的作用下，AtTLP1基因在擬南芥Arabidopsis thaliana根部維管束特異性表達；而在轉基因擬南芥中，由CKTLP和綠色熒光蛋白構成的融合蛋白在細胞外或細胞壁上表達[10]。也有研究表明:一種特定的楊樹TLP1蛋白在有明顯維管系統(例如中脈，葉柄和莖)的組織中表達，而另一種TLP主要在嫩葉和枝條尖部的淀粉儲藏質粒體中表達[11]。

植物基因組中的TLPs基因以基因家族的形式出現，如模式植物楊樹、擬南芥、水稻Oryza sativa基因組中分別有 55 個[12]、24 個[12]、30 個基因[6]。不同于動物和真菌的單系 TLPs基因類群[13]，系統發育分析表明植物 TLPs基因家族是一個由10個類群構成的復系類群，這10個類群分別起源于單子葉與雙子葉植物分化之前的10個祖先序列。在植物漫長的進化過程中，經過染色體復制、基因復制、基因轉換以及突變最終在不同的植物中形成為數目不一的基因家族[13－14]。與植物PR1基因家族、β-1，3-葡聚糖酶類似，具有抗微生物活性的TLPs被認為是植物天然免疫系統的組成之一[15]，考慮到TLPs基因的古老起源、廣泛分布以及之后在漫長的進化歷史中的頻繁發生基因復制事件，這些都預示著TLPs在植物抗逆反應中的重要作用，而且研究證明 TLPs基因的適應性進化過程仍然在持續[16]，預期植物尤其是木本植物 TLPs基因家族還會隨著環境脅迫壓力發生一定程度的適應性進化。

2 TLPs的結構特征

TLPs最為重要的結構特征在于其分子中由16個半胱氨酸殘基配對形成的8個二硫鍵，由于這些二硫鍵的存在，使得 TLPs具有了相對穩定的化學結構，能夠抗熱，抗酶解和抗酸堿[17－19]。一些 TLPs含有N端信號肽，用于引導成熟的蛋白到分泌路徑。逆滲透蛋白(osmotin)和植物OLPs還具有C端前導肽，用于引導蛋白到達液泡[20]。

TLPs分子的三級結構一般由3個結構域構成，結構域Ⅰ由11個β片層(β-sheet)反向平行折疊形成，結構域Ⅱ和結構域Ⅲ主要由α螺旋區域構成[21－23]，而結構域Ⅰ和結構域Ⅱ之間形成一個具有強烈電負性的裂縫(cleft)[23]。然而也有一些特殊的 TLPs，其三級結構只具有結構域Ⅰ和結構域Ⅱ，甚至有些TLPs僅僅包含結構域Ⅰ，因此，植物TLPs的分子量大小不等，一般為16～40 kDa，然而不論分子量如何變化，TLPs的氨基酸序列高度同源，并且具有相似的生理學特征。

3 TLPs的生理功能

3.1 抗真菌活性

抗真菌活性是TLPs的主要功能之一。TLPs參與多種植物病原真菌侵染之后的主動防御反應，如水稻紋枯病菌 Rhizocotonia solani的侵染可誘導水稻 TLPs基因表達，增強它對該病原菌的抗性[24－25]；煙草逆滲透蛋白具有裂解致病疫霉Phytophthora infestans孢子，抑制菌絲生長的功能[26]。牛心樸子Cynanchum komarovii CKTLP對輪枝菌屬Verticillium dahliae，尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和絲核菌Rhizoctonia solani等真菌生長有抑制[10]。葡萄Vitis vinifera藤TLPs(VvTLP-1)在體外能明顯抑制痂囊腔菌屬 Elsinoe ampelina 孢子的萌發和菌絲生長[27]。

林木受到病原物侵染之后也有類甜蛋白產生。Zamani等[28]從花旗松Pseudotsuga menziesii中分離了第一個林木類甜蛋白(PmTLP)，Western blot顯示該蛋白在受真菌感染的根部比非感染區域含量顯著增高，說明該蛋白參與寄主抗真菌防御反應。研究還表明:該蛋白可能具有阻止真菌在樹木體內進一步擴展的作用。Piggott等[29]發現茶藨子生柱銹菌 Cronartium ribicola可誘導西部白皮松類甜蛋白 Pin mTLP在受感染植株干部周圍表達，Pin mTLP的表達對松樹皰銹病Cronartium ribicola的發展有一定抑制作用。

研究表明:植物TLPs主要通過裂解真菌孢子，抑制孢子萌發，降低幼嫩菌絲活力等方式對致病和非致病真菌產生抑制作用[26，30－33]。并且轉TLPs基因植物能夠延緩多種真菌病害發展過程，如葡萄孢Bostrytis sp.，鐮刀菌 Fusarium sp.，絲核菌 Rhizoctonia sp.，核盤菌Sclerotinia sp.等引起的病害發展過程，增強轉基因植物對病原真菌的抗性[34－38]。

3.2 β-1，3-葡聚糖酶活性

Grenier等[7，39]發現許多不同來源的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性。大麥 Hordeum vulgare的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性，能夠結合并水解 β-1，3-葡聚糖[39－42]。蘋果 Malus pumila 和櫻桃 Prunus avium中的 TLPs也具有中等的β-1，3-葡聚糖酶活性[42]。Martin等[43]研究顯示:一些發病的真菌和另外一些絲狀真菌分泌的葡聚糖酶能夠降解真菌細胞壁。研究發現:煙草 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性與蛋白質分子表面的酸性裂縫中的2個保守的酸性氨基酸殘基有關[44]。通過蛋白質建模以及功能分析，筆者發現:部分楊樹TLPs中也有保守性的Glu92-Asp110氨基酸殘基存在，并且這2個殘基中的活性氧原子處于催化活性發揮的正確位置，因此，認為部分楊樹 TLPs也具有β-1，3-葡聚糖酶活性[9]。研究表明:這個結構與TLPs的生理功能有密切聯系。

然而，相對與真正的β-1，3-葡聚糖酶催化位點之間的較短距離[45]，楊樹，玉米Zea mays，草莓Fragaria ananassa等 TLPs分子的催化位點之間較長的距離[16]，可能解釋了 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性較低的事實，因此，Menu-Bouaouiche等[42]認為，僅僅TLPs本身可能無法直接通過破壞真菌細胞壁，而是通過β-1，3-葡聚糖酶反應的產物來誘導植物的防御反應進而抵抗真菌的侵染。

3.3 其他活性

除了抗真菌活性和β-1，3-葡聚糖酶活性外，許多研究還發現 TLPs具有酶抑制劑活性。來自玉米的抗真菌蛋白(zeamatin)是較早被鑒定出的具有淀粉酶抑制劑活性的 TLPs[30，46]。抗真菌蛋白通過抑制昆蟲淀粉酶活性，阻礙昆蟲消化吸收食物中的碳水化合物,減少糖分攝取，造成昆蟲營養不良和能量不足，進而導致昆蟲死亡。因此，Franco等[47]建議利用具有а-淀粉酶抑制劑活性的 TLPs來控制象鼻蟲(weevils)等以淀粉為主要食物的有害生物。

一些植物果實和花粉中的TLPs具有植物過敏原活性。第一個被鑒定出具有過敏原活性的 TLPs是來自蘋果的 Mal d 2[48]。并且 Krebitz等[49]發現重組的煙草花葉病毒在煙草中表達的 Mal d 2也具有過敏原活性。繼 Mal d 2 之后，又從甜椒 Capsicum annuum[50]，櫻桃 Prunus arium[51]，獼猴桃 Actinidia sp.[52]，葡萄[53]和 香蕉Musa supientum[54]的果肉中分離出具有過敏原活性的 TLPs。由于果實中含有大量水分和甜味物質，很容易被真菌或昆蟲侵襲，因此，Hoffmann-Sommergruber[55]認為:組成型表達于特定發育階段的 TLPs可以對果實起到快速保護作用。也有研究者從杜松Juniperus ashei[56]，綠干柏Cupressus arizonica[57]和日本柳杉 Cryptomeria japonica[58]的花粉中分離出具有過敏原活性的 TLPs Jun a 3，Cup a 3，Cry j 3。此外，引起人類過敏癥的過敏原中也包括TLPs，Palacín等[59]在研究中發現桃子Prunus persica中的3種 TLPs是桃的首要過敏原。Lehto等[60]發現小麥中的 TLPs是與面包房哮喘相關的最新的過敏原。筆者發現:部分楊樹 TLPs具有過敏原活性，并且這些TLPs多數在美洲黑楊及青楊花粉中表達(待發表)。因此，春季楊樹花粉中特定TLPs基因的表達可能是造成部分人群過敏的原因之一，然而過敏原活性對于楊樹、松樹等的生理意義仍是值得深入探討的問題。

一些研究者發現:植物 TLPs還具有抗凍活性,木聚糖酶抑制劑活性和抗蟲活性。Hon等[61]通過氨基末端序列比較，免疫交叉反應和酶活性分析，在冬黑麥Secale cereale的葉片質外體中分離出2個具有抗凍活性的 TLPs(25 kDa和16 kDa)；最近的研究發現一種來自小麥的新型木聚糖酶抑制劑(TLX1)屬于TLP家族，重組的TLX1蛋白對長枝木霉Trichoderma longibrachiatum木聚糖酶XynI有抑制活性[62]；新近研究表明:被麥二叉蚜Schizaphis graminum取食后，高粱Sorghum vulgare TLPs基因上調表達，因此，證明TLPs與植物抵御昆蟲反應有關[63]。

4 TLPs的抗真菌機制

雖然已有很多關于TLPs抗真菌活性的報道，但是植物TLPs抗真菌病害的詳細分子機制還不明確。由于玉米類甜蛋白抗真菌蛋白可以導致鏈孢霉Neurospora crassa細胞的快速裂解，而煙草逆滲透蛋白也能夠導致白色念珠菌Candida albicans細胞內容物迅速外溢而致死。因此，早期研究認為:植物TLPs促使真菌細胞膜形成小孔，從而使水流入，進而引起細胞滲透破裂，來達到抗菌目的[20，26]。然而，結構分析表明: 抗真菌蛋白和逆滲透蛋白并不具有導致細胞膜孔洞形成的特征[26，33]。

Menu-Bouaouiche等[42]認為: TLPs結構域Ⅰ和結構域Ⅱ之間的酸性裂縫與抗真菌活性有關[64－66]。然而，Chan等[67]發現冬黑麥Secale cereale中的 TLPs只具有結構域Ⅰ中的酸性殘基，沒有裂縫結構，也具有抗真菌活性。所以，他們認為TLPs結構域Ⅰ中的酸性殘基與真菌細胞膜上的水通道蛋白、離子通道蛋白和滲透感受器之間的相互作用，使得TLPs具有了抗真菌活性。通過適應性進化和蛋白質三級結構分析，Zhao和 Su[16]進一步證明了楊樹 TLPs分子表面酸性裂縫與抗真菌活性之間的相關性。

另外，TLPs的裂縫區域是一個典型的碳水化合物的結合位點，Osmond等[40]用實驗證明 TLPs與線性β-1，3-葡聚糖的結合發生于裂縫區域，裂縫區域內的幾個殘基與真菌細胞壁的碳水化合物形成氫鍵，并且芳香族氨基酸在裂縫處參與形成堆積力共同破壞了真菌細胞壁的結構，使TLPs與細胞膜接觸，造成真菌細胞死亡。改變細胞壁結構是 TLPs抑制真菌侵染的先決條件。TLPs除了與細胞壁上的 β-1，3-葡聚糖特異性結合改變細胞壁結構外，還可以通過其他的途徑改變細胞的結構。煙草逆滲透蛋白能夠誘導酵母有絲分裂過程中的促細胞分裂原活化蛋白激酶(MAP-kinase)的表達，通過改變細胞壁結構使逆滲透蛋白能夠與細胞膜接觸而導致細胞死亡[68]。

TLPs的抗真菌機制不僅與真菌細胞壁破壞和真菌細胞膜透性改變有關之外，還與木質素，植保素等抗性物質的合成以及抗性結構的形成有關，植物TLPs表現的抗真菌活性很可能是與這些防御機制協同作用的結果。

5 TLPs基因的表達

TLPs基因一般在植物特定組織、器官中低水平組成型表達，而且表達活性不同。如草莓TLPs基因在葉和花冠中表達量最多，在根中表達量中等，在未成熟果實中表達量最少[69]。受到外界逆境脅迫后，TLPs基因的表達可以迅速上調。研究表明:被麥二叉蚜取食的高粱中TLPs基因的轉錄增加幾千倍[63]。草莓Fragaria ananassa受到脫落酸脅迫6 h后，體內TLPs表達量為最初表達量的8.8倍；受水楊酸脅迫48 h后，TLPs基因表達量為最初的30.5倍；而機械損傷可以誘導其 TLPs表達量增加7.8倍[69]。

TLPs基因的表達與植物生長環境(生長狀態)和植物抗病性有關。植物生長狀態方面，如雪松Cedrus deodara花粉中具有過敏原活性的 TLPs在不同年份的含量差別高達5.0倍以上[70]。大麥和燕麥Avena sativa從子房壁發育到糊粉層的過程中，TLPs基因的表達發生了改變[71]。一種胡椒TLP基因也是在果實成長過程中表達[72]。一種葡萄糖甘酸酶啟動子聚變(融合)研究發現日本梨Pyrus serotina的TLP基因(PsTL1)特定的在雌蕊和花藥中低水平表達，但是在其他花器官和葉子中沒有表達[73]。植物抗病性方面，小麥冠腐病菌Fusarium pseudograminearum侵染4 d后，小麥抗病品種中TLPs基因表達顯著高于感病品種[74]。林木中，Petre等[13]最近發現楊樹TLPs基因的表達可能與楊樹對于楊柵銹菌Melampsora sp.的抗性有關。然而，也有一些TLPs基因對病原菌脅迫不敏感，而在植物受到生理、化學或物理因素誘導時大量表達。例如:有些 TLPs基因只有在植物的某些發育階段的特定器官，如檢測到 Ban-TLP，Mal-TLP和Pru-TLP在香蕉、蘋果以及梨的果實中高量表達[42]。

最新研究顯示:在TLPs基因表達受啟動子調控。啟動子中的沉默子會抑制防御反應中生姜Zingiber officinale TLPs(ZoPR5)的表達。啟動子中的GT-1 box和TGTCA可以激活植物防御反應中林亡果姜Curcuma amada TLPs(CaPR5)的表達[75]。

進一步分析研究表明: TLPs基因家族的特定成員在特定條件下的表達模式并不相同。筆者的研究表明:室溫光照培養條件下，楊樹TLPs基因的55個成員中，有37個基因至少在根、成熟皮、嫩皮、成熟葉、嫩葉5個部位中的1個部位表達，而僅有4個基因在全部5個部位同時表達，并且這些表達的基因分布在除類群9之外的9個不同的系統發育類群中；同時初步研究表明:類群5及類群6中的多數TLPs基因的表達與真菌侵染存在相關性(未發表)，考慮到系統發育特征，因此以往研究中 TLPs基因的復雜多樣的表達特征以及功能特征可能是 TLPs基因家族不同成員的特征的集合，對于植物 TLPs基因的功能需要在全基因組水平上進行細致的研究，目前，楊樹 TLPs基因的差異表達模式及TLPs基因家族不同成員的功能驗證工作正在進行中。

6 TLPs基因在植物抗病育種方面的應用

由于具有有效的抗真菌作用，TLPs基因現已被應用到多種作物的抗真菌基因工程中，并且取得了理想的效果。Kuwabara等[76]克隆了冬小麥taTLPs基因，其表達蛋白在低溫下能夠抑制小麥雪霉葉枯病菌Microdochium nivale菌絲的生長，增強冬小麥的雪霉病抗性。研究顯示:小麥TLPs基因的表達可以減輕由Fusarum pseudograminearum導致的小麥冠腐病癥狀[74]。另外，將水稻TLP基因轉入小麥中，可增強小麥對小麥禾谷鐮刀菌F.graminearum的抗性[35]。超量表達的CKTLP明顯的提高了擬南芥對輪枝菌Verticillium dahliae 的抗性[10]。

組成型表達逆滲透蛋白的轉基因煙草對交鏈孢菌Alternaria sp.的抗性得到明顯增強[77]。轉逆滲透蛋白基因的馬鈴薯Solanum tuberosum，晚疫病癥狀減輕，抗病性得到增強[37]；超量表達類似逆滲透蛋白(osmotin-like)的轉基因馬鈴薯對致病疫霉的抗性增強[3]。

組成型表達TLPs的轉基因水稻抗真菌能力明顯增強[78]；在秈稻優良品種中超量表達水稻TLPs基因增強了其對水稻紋枯病致病菌 Rhizoctonia solani和水稻葉鞘腐敗病菌Sarocladium oryzae的抗性[79]。將水稻 TLPD34導入匍匐剪股穎 Agrostis palustris中，能夠增強其對幣斑病菌 Sclerotinia homoeocarpa的抗性[25]。重組龍葵 Solanum nigrum TLPs(SnOLP)在體外對 Fusarium solani f.sp.glycines，Colletotrichum spp.，Macrophomina phaseolina和Phytophthora nicotiana var.parasitic等植物病原真菌的生長均具有抑制活性[80]。TLPs基因已經在多種植物中成功表達，轉基因植物顯示的對于多種病原真菌的抗性揭示培育轉TLPs基因植物將是植物抗病育種的有效途徑之一，然而在林木TLPs基因的遺傳轉化仍未見報道。

7 問題與展望

對于植物TLPs基因家族，雖然在其結構，生理功能等方面已經有了大量的研究，在植物轉基因抗病育種中也有了一些較為成功的應用實例，但在 TLPs的功能、TLPs誘導植物抗性的信號傳遞、與TLPs基因有關的多基因聚合育種等方面仍有許多問題有待深入探討。首先，如前所述，雖然TLPs是與抗真菌有關的許多特性已經得到證明，但是TLPs抗真菌活性的核心機理有待進一步闡明，而這將會對TLPs分子功能的定向設計奠定基礎，從而有利于TLPs抗真菌功能的進一步發揮。其次，植物TLPs基因家族是由10個具有共同起源的旁系類群構成，不同類群內的 TLPs基因高度分化，而已經報道的TLPs基因多數屬于類群5和類群6，其他類群的 TLPs是否具有相近的功能，或者說TLPs的不同分支是否對應于不同的生理功能，這仍然是一個需要深入研究的課題。第三，研究發現:在不同的條件下，植物特定 TLPs基因的表達分別與茉莉酸(JA)，乙烯(ET)及水楊酸(SA)信號傳導途徑有關，而病原菌脅迫過程中，茉莉酸以及 水楊酸信號傳導途徑分別與酸性以及堿性 PR蛋白有關[81]，然而具體到TLPs基因家族，誘導酸性、堿性TLPs產生的信號傳導機制仍然不明確。對于以上問題的探索，將會有助于對外來生物或非生物脅迫出現時，植物天然免疫系統發揮免疫作用細節的了解。第四，基于TLPs基因家族的功能特性，顯而易見，通過研究真菌病害過程中TLPs基因的表達特征，探討TLPs與林木抗病性之間的聯系，發現有效地林木抗病性相關TLPs基因并實現遺傳轉化，將是當今林木病理學和遺傳育種研究中的重要內容之一。另外，由于已經發現很多TLPs與人體的過敏反應有關，因此，林木，尤其對于在中國具有廣泛栽植面積的楊樹、松樹所引起的過敏性疾病的防治不僅是一個亟待解決的公共衛生課題，也是林木遺傳育種研究中需要引起關注的重要問題。

[1]van LOON L C，van STRIEN E A.The families of pathogenesis-related proteins，their activities，and comparative analysis of PR-1 proteins [J].Physiol Mol Plant Pathol，1999，55: 85－97.

[2]van LOON L C，PIERPOINT W S，BOLLER T，et al.Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins [J].Plant MolBiol Rep，1994，12 (3): 245-264.

[3]ZHU Baolong，CHEN T H H，LI P H.Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein [J].Planta，1996，198: 70-77.

[4]KITAJIMA S，SATO F.Plant pathogenesis-related proteins:molecular mechanisms of gene expression and protein function [J].J Biochem，1999，125 (1): 1-8.

[5]BRANDAZZA A，ANGELI S，TEGONI M，et al.Plant stress proteins of the thaumatin-like family discovered in animals [J].FEBS Lett，2004，572 (1/3 ): 3-7.

[6]SHATTERS R G Jr，BOYKIN L M，LAPOINTE S L，et al.Phylogenetic and structural relationships of the PR-5 gene family reveal an ancient multigene family conserved in plants and select animal taxa [J].J Mol Evol，2006，63 (1):12-29.

[7]GRENIER J，POTVIN C，ASSELIN A.Some fungi express β-1，3-glucanases similar to thaumatin-like proteins [J].Mycologia，2000，92 (5): 841-848.

[8]SAKAMOTO Y，WATANABE H，NAGAI M，et al.Lentinula edodes tlg1 encodes a thaumatin-like protein that is involved in lentinan degradation and fruiting body senescence [J].Plant Physiol，2006，141: 793-801.

[9]LéON-KLOOSTERZIEL K M，VERHAGEN B W M，KEURENTJES J J B，et al.Colonization of the Arabidopsis rhizosphere by fluorescent Pseudomonas spp.activates a root-specific，ethylene-responsive PR-5 gene in the vascular bundle [J].Plant Mol Biol，2005，57: 731-748.

[10]WANG Qinghua，LI Fuguang，ZHANG Xue，et al.Purification and characterization of a CKTLP protein from Cynanchum komarovii seeds that confers antifungal activity [J].PLoS One，2011，6 (2): e16930.doi: 10.1371/journal.pone.0016930.

[11]DAFOE N J，GOWEN B E，CONSTABEL C P.Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar [J].BMC Plant Biol，2010，10: 191.

[12]TUSKAN G A，DIFAZIO S，JANSSON S，et al.The genome of black cottonwood，Populus trichocarpa (Torr.＆ Gray)[J].Science，2006，313 (5793): 1596-1604.

[13]BENJAMIN P，IAN M，NICOLAS R，et al.Genome-wide analysis of eukaryote thaumatin-like proteins(TLPs) with an emphasis on poplar [J].BMC Plant Biol，2011，11: 33.

[14]SHATTERS R G Jr，BOYKIN L M，LAPOINTE S L，et al.Phylogenetic and structural relationships of the pr5 gene family reveal an ancient multigene family conserved in plants and select animal taxa [J].J Mol Evol，2006，63(1): 12-29.

[15]BORREGAARD N，ELSBACH P，GANZ T，et al.Innate immunity: from plants to humans [J].Immunol，Today，2000，21 (1): 68-70.

[16]ZHAO Jiaping，SU Xiaohua.Patterns of molecular evolution and predicted function in thaumatin-like proteins of Populus trichocarpa [J].Planta，2010，232 (4): 949-962.

[17]VELAZHAHAN R，DATTA S K，MUTHUKRISHNAN S.The PR-5 family: thaumatin-like proteins[G]//DATTA S K，MUTHUKRISHNAN S.Pathogenesis-Related Proteins in Plants.Boca Raton: CRC Press，1999: 118-140.

[18]SMOLE U，BUBLIN M，RADAUER C，et al.Mal d 2，the thaumatin-like allergen from apple，is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing [J].Int Arch Allergy Immunol，2008，147 (4): 289-298.

[19]FIERENS E，GEBRUERS K，VOET A R D，et al.Biochemical and structural characterization of TLXI，the Triticum aestivum L.thaumatin-like xylanase inhibitor[J].J Enzyme Inhib Med Chem，2009，24 (4): 646-654.

[21]OGATA C M，GORDON P F，de VOS AM，et al.Crystal structure of a sweet tasting protein thaumatin I，at 1.65 A resolution [J].J Mol Biol，1992，228: 893-908.

[22]BATALIA M A，MONZINGO A F，ERNST S，et al.The crystal structure of the antifungal protein zeamatin，a member of the thaumatin-like，PR-5 protein family [J].Nat Struct Biol，1996，3: 19-23.

[23]GHOSH R，CHAKRABARTI C.Crystal structure analysis of NP24-I: a thaumatin-like protein [J].Planta，2008，228(5): 883-890.

[24]VELAZHAHAN R，CHENCOLE K，ANURATHA C S，et al.Induction of thaumatin-like protein (TLPs) in Rhizoctonia solani-infected rice and characterization of two new cDNA clones [J].Physiol Plantarum，1998，102: 21-28.

[25]FU Daolin，TISSERAT N A，XIAO Yanmei，et al.Over expression of a rice TLPD34 enhances dollar-spot resistance in transgenic bent grass [J].Plant Sci，2005，168 (3): 671-680.

[26]ABAD L R，D′URZO M P，LIU Dong，et al.Antifungal activity of tobacco osmotin has specificity and involves plasma membrane permeabilization [J].Plant Sci，1996，118 (1): 11-23.

[27]JAYASANKAR S，LI Zhijian，GRAY D J.Constitutive expression of Vitis vinifera thaumatin-like protein after in vitro selection and its role in anthracnose resistance [J].Funct Plant Biol，2003，30 (11): 1105-1115.

[28]ZAMANI A，STURROCK R N，EKRAMODDOULLAH A K，et al.Gene cloning and tissue expression analysis of a PR-5 thaumatin-like protein in Phellinus weirii-infected Douglas-fir[J].Biochem Cell Biol，94 (11): 1235-1243.

[29]PIGGOTT N，EKRAMODDOULLAH A K M，LIU Junjun，et al.Gene cloning of a thaumatin-like(PR-5)protein of western white pine (Pinus monticola D.Don) and expression studies of members of the PR-5 group [J].Physiol Mol Plant Pathol，2004，64 (1): 1-8.

[30]ROBERTS W K，SELITRENNIKOFF C P.Zeamatin，an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity [J].Microbiology，1990，136 (9): 1771-1778.

[31]WOLOSHUK C P，MEULENHOFF J S，SELA-BUURLAGE M，et al.Pathogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytopthora infestans [J].Plant Cell，1991，3 (6): 619-628.

[32]HU Xu，REDDY A S N.Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein [J].Plant Mol Biol，1997，34 (6): 949-959.

[33]KOIWA H，KATO H，NAKATSU T，et al.Purification and characterization of tobacco pathogenesis-related protein PR-5d，an antifungal thaumatin-like protein [J].Plant Cell Physiol，1997，38 (7): 783-791.

[34]PUNJA Z K.Genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens-a review of progress and future prospects [J].Can J Plant Pathol，2001，23: 216-235.

[35]CHEN W P，CHEN P D，LIU D J，et al.Development of wheat scab symptoms is delayed in transgenic wheat plants that constitutively express a rice thaumatin-like protein gene [J].Theor Appl Genet，1999，99 (5): 755-760.

[36]DATTA K，VELAZHAHAN R，OLIVA N，et al.Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5)gene in transgenic rice plants enhances environmentally friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease [J].Theor Appl Genet，98: 1138-1145.

[37]LIU Dong，RAGHOTHAMA K G，HASEGAWA P M，et al.Osmotin over expression in potato delays development of disease symptoms [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91 (5): 1888-1892.

[38]LIU Dong，RHODES D，D’URZO M P，et al.In vivo and in vitro activity of truncated osmotin that is secreted into the extracellular matrix [J].Plant Sci，1996，121 (2): 123-131.

[39]GRENIER J，POTVIN C，TRUDEL J，et al.Some thaumatin-like proteins hydrolyze polymeric β-1，3-glucans [J].Plant J，1999，19 (4): 473-480.

[40]OSMOND R I，HRMOVA M，FONTAINE F，et al.Binding interactions between barley thaumatin-like proteins and(1，3)-β-D-glucans: kinetics，specificity，structural analysis and biological implications [J].Euro J Biochem，2001，268 (15): 4190-4199.

[41]TRUDEL J，GRENIER J，POTVIN C，et al.Several thaumatin-like proteins bind to β-1，3-glucans [J].Plant Physiol，1998，118 (4): 1431-1438.

[42]MENU-BOUAOUICHE L，VRIET C，PEUMANS W J，et al.A molecular basis for the endo-β-1，3-glucanase activity of the thaumatin-like proteins from edible fruits [J].Biochimie，2003，85 (1/2): 123-131.

[43]MARTIN K，McDOUGALL B M，MCILROY S，et al.Biochemistry and molecular biology of exocellular fungal β-(1，3)-and β-(1，6)-glucanases [J].FEMS Microbiol Rev，2007，31 (2): 168-192.

[44]GHOSH R，CHAKRABARTI C.Crystal structure analysis of NP24-I: a thaumatin-like protein [J].Planta，2008，228(5): 883-890.

[45]ZECHEL D L，WITHERS S G.Dissection of nucleophilic and acid-base catalysis in glycosidases [J].Curr Opin Chem Biol，2001，5 (6): 643-649.

[46]SCHIMOLER-óROURKE R，RICHARDSON M，SELITRENNIKOFF C P.Zeamatin inhibits trypsin and alpha-amylase activities [J].Appl Environ Microbiol，2001，67 (5): 2365-2366.

[47]FRANCO O L，RIGDEN D J，MELO F R.Plant α-amylase inhibitors and their interaction with insect α-amylases[J].Eur J Biochem，2002，269 (2): 397-412.

[48]HSIEH L S，MOOS M Jr，LI Yuan.Characterization of apple 18 and 31 kd allergens by microsequencing and evaluation of their content during storage and ripening [J].J Allergy Clin Immunol，1995，96 (6): 960-970.

[49]KREBITZ M，WAGNER B，FERREIRA F，et al.Plant-based heterologous expression of mal d 2，a thaumatin-like protein and allergen of apple (Malus domestica)，and its characterization as an antifungal protein [J].J Mol Biol，2003，329 (4): 721-730.

[50]JENSEN-JAROLIM E，SANTNER B，LEITNER A，et al.Bell peppers(Capsicum annuum)express allergens(profilin，pathogenesis-related protein P23 and bet v 1) depending on the horticultural strain [J].Int Arch Allergy Immunol，1998，116 (2): 103-109.

[51]INSCHLAG C，HOFFMANN-SOMMERGRUBER K，O'RIORDAIN G，et al.Biochemical characterization of Pru a 2，a 23-kD thaumatin-like protein representing a potential major allergen in cherry (Prunus avium) [J].Int Arch Allergy Immunol，1998，116 (1): 22-28.

[52]GAVROVI?-JANKULOVI? M，?IRKOVI? T，VU?KOVI? O，et al.Isolation and biochemical characterization of a thaumatin-like kiwi allergen [J].J Allergy Clin Immunol，2002，110 (5): 805-810.

[53]PASTORELLO E A，FARIOLI L，PRAVETTONI V，et al.Identification of grape and wine allergens as an endochitinase 4，a lipid-transfer protein，and a Thaumatin [J].J Allergy Clin Immunol，2003，111 (2): 350-359.

[54]LEONE P，MENU-BOUAOUICHE L，PEUMANS W J，et al.Resolution of the structure of the allergenic and antifungal banana fruit thaumatinlike protein at 1.7-A [J].Biochimie，2006，88: 45-52.

[55]HOFFMANN-SOMMERGRUBER K.Plant allergens and pathogenesis-related proteins [J].Int Arch Allergy Immunol，2000，122 (3): 155-166.

[56]MIDORO-HORIUTI T，GOLDBLUM R M，KUROSKY A，et al.Variable expression of pathogenesis-related protein allergen in mountain cedar (Juniperus ashei) pollen [J].J Immunol，2000，164 (4): 2188-2192.

[57]CORTEGANO I，CIVANTOS E，ACEITUNO E，et al.Cloning and expression of a major allergen from Cupressus arizonica pollen，cup a 3，a PR-5 protein expressed under polluted environment [J].Allergy，2004，59 (5): 485-490.

[58]FUJIMURA T，FUTAMURA N，MIDORO-HORIUTI T，et al.Isolation and characterization of native cry j 3 from Japanese cedar(Cryptomeria japonica) pollen [J].Allergy，2007，62 (5): 547-553.

[59]PALACíN A，TORDESILLAS L，GAMBOA P，et al.Characterization of peach thaumatin-like proteins and their identification as major peach allergens [J].Clin ＆ Exp Allergy，2010，40 (9): 1422-1430.

[60]LEHTO M，AIRAKSINEN L，PUUSTINEN A，et al.Thaumatin-like protein and baker’s respiratory allergy [J].Ann Allergy Asthma ＆ Immunol，2010，104 (2): 139-146.

[61]HON W C，GRIFFITH M，MLYNARZ A，et al.Antifreeze proteins in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins [J].Plant Physiol，1995，109 (3): 879-889.

[62]FIERENS E，ROMBOUTS S，GEBRUERS K，et al.TLXI，a novel type of xylanase inhibitor from wheat(Triticum aestivum) belonging to the thaumatin family [J].Biochem J，2007，403: 583-591.

[63]CHOU Juan，HUANG Yinghua.Differential expression of thaumatin-like proteins in sorghum infested with greenbugs[J].Z Naturforsch，2010 ，65 (3/4): 271-276.

[64]BATALIA M A，MONZINGO A F，ERNST S，et al.The crystal structure of the antifungal protein zeamatin，a member of the thaumatin-like，PR-5 protein family [J].Nat Struct ＆ Mol Biol，1996，3: 19-23.

[65]KOIWA H，KATO H，NAKATSU T，et al.Crystal structure of tobacco PR-5d protein at 1.8 A°resolution reveals a conserved acidic cleft structure in antifungal thaumatin-like proteins [J].J Mol Biol，1999，286: 1137-1145.

[66]MIN K，HA S C，HASEGAWA P M，et al.Crystal structure of osmotin，a plant antifungal protein [J].Proteins Struct Funct Bioinform，2004，54: 170-173.

[67]CHAN Y W，TUNG W L，GRIFFITH M，et al.Cloning of a cDNA encoding the thaumatin-like protein of winter rye (Secale cereale L.Musketeer) and its functional characterization [J].J Exp Bot，1999，50 (339): 1627-1628.

[68]YUN D J，ZHAO Y，PARDO J M，et al.Stress proteins on the yeast cell surface determine resistance to osmotin，a plant antifungal protein [J].PNAS，1997，94 (13): 7082-7087.

[69]ZHANG Yuhua，SHIH D S.Isolation of an osmotin-like protein gene from strawberry and analysis of the response of this gene to abiotic stresses [J].J Pant Physiol，2007，164 (1): 68-77.

[70]MIDORO-HORIUTI T，GOLDBLUM R M.，KUROSKY A，et al.Variable expression of pathogenesis-related protein allergen in mountain cedar (Juniperus ashei) pollen [J].J Immunol，2000，164 (4): 2188-2192.

[71]SKADSEN R W，SATHISH P，KAEPPLER H F.Expression of thaumatin-like permatin PR-5 genes switches from the ovary wall to the aleurone in developing barley and oat seeds [J].Plant Sci，2000，156 (1): 11-22.

[72]KIM Y S，PARK J Y，KIM K S，et al.A thaumatin-like gene in nonclimacteric pepper fruits used as molecular marker in probing disease resistance，ripening，and sugar accumulation [J].Plant Mol Biol，2002，49 (2): 125-135.

[73]SASSA H，USHIJIMA K，HIRANO H.A pistil-specific thaumatin/PR5-like protein gene of Japanese pear(Pyrus serotina): sequence and promoter activity of the 50 region in transgenic tobacco [J].Plant Mol Biol，2002，50 (3):371-377.

[74]DESMONDOJ O J，EDGAR C I，MANNERS J M，et al.Methyl jasmonate induced gene expression in wheat delays symptom development by the crown rot pathogen Fusarium pseudograminearum [J].Physiol Mol Plant Pathol，2006，67(3/5): 171-179.

[75]PRASATH D，EL-SHARKAWY I，SHERIF S，et al.Cloning and characterization of PR-5 gene from Curcuma amada and Zingiber officinale in response to Ralstonia solanacearum infection [J/OL].Plant Cell Rep.2011-05-19 [2011-05-28].http: //www.springerlink.com/content/7pnr204736343np2/fulltext.pdf.

[76]KUWABARA C ，TAKEZAWA D，SHIMADA D，et al.Abscisic acid-and cold-induced thaumatin-like protein in winter wheat has an antifungal activity against snow mould，Microdochium nivale [J].Physiol Plantarum，2002，115(1): 101-110.

[77]VELAZHAHAN R，MUTHUKRISHNAN S.Transgenic tobacco plants constitutively overexpressing a rice thaumatinlike protein (PR-5) show enhanced resistance to Alternaria alternata [J].Biol Plant，2003，47 (3): 347-354.

[78]DATTA K，VELAZHAHAN R，OLIVA N，et al.Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5)gene in transgenic rice plants enhances environmentally friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease [J].Theor Appl Genet，1999，98: 1138-1145.

[79]KALPANA K，MARUTHASALAM S，RAJESH T，et al.Engineering sheath blight resistance in elite indica rice cultivars using genes encoding defense proteins [J].Plant Sci，2006，170 (2): 203-215.

[80]CAMPOS M A，SILVA M S，MAGALHES C P，et al.Expression in Escherichia coli，purification，refolding and antifungal activity of an osmotin from Solanum nigrum [J].Microbial Cell Factories，2008，7: 1-7.

[81]KUNKEL B N，BROOKS D M.Cross talk between signaling pathways in pathogen defense [J].Curr Opin Plant Biol，2002，5 (4): 325-331.