綠膿桿菌肺炎動物模型建立與影像學(xué)評價方法的初步探索*

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院影像科（上海 200003）

李 斌 朱冬青 劉洪超 于 紅 劉士遠(yuǎn)

肺部感染中的醫(yī)院獲得性肺炎（Hospital-acquired pneumonia,HAP）由于癥狀被基礎(chǔ)疾病或所用藥物掩蓋、病原學(xué)標(biāo)本易被污染，診斷存在一定困難和延遲性，死亡率較高。綠膿桿菌是HAP特別是ICU患者肺炎的主要院內(nèi)病原菌，可能在人體潮濕部位如會陰部、腋窩、耳朵等處發(fā)生定植，并在抗生素治療中易變異而形成多重耐藥，所以在臨床存在過度治療或治療不佳的問題。因此我們采用噴霧吸入法來建立家兔綠膿桿菌肺炎模型，以期為綠膿桿菌肺炎尤其是呼吸機(jī)相關(guān)肺炎的研究提供可行的動物模型基礎(chǔ)。

材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)菌 健康新西蘭大白兔24只，兔齡6-10個月，體重2.0-2.3kg，雌雄不拘，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物實驗中心提供。臨床分離的綠膿桿菌，經(jīng)VITEX微生物自動分析儀及藥敏鑒定，由上海長征醫(yī)院呼吸科實驗室提供。

1.2 試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基；MH肉湯；0.9%滅菌生理鹽水；戊巴比妥鈉。

1.3 主要儀器設(shè)備 普通光學(xué)顯微鏡（日本 Olympuls），CT（Somatom Sensation 16排螺旋CT），噴霧吸入器，病理切片機(jī)，細(xì)菌培養(yǎng)箱，麥?zhǔn)媳葷醿x。

1.4 實驗方法

①細(xì)菌培養(yǎng)：將粘液型綠膿桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后常規(guī)方法保存。挑取4℃保存的菌落少許，置于MH肉湯中37℃孵育過夜。配置為0.5個麥?zhǔn)蠁挝唬ㄏ喈?dāng)于1.5X108CFU/ml）的PA菌懸液。新鮮菌懸液使用當(dāng)天制備。

②動物分組：新西蘭兔經(jīng)1周飼養(yǎng)后，按體重隨機(jī)分為2組，實驗組（A組）12只，對照組（B組）12只，置于上海市公共衛(wèi)生臨床中心P2實驗室動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)。

③麻醉和實驗處理：經(jīng)耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉lml/kg麻醉家兔。實驗組采用噴霧吸入器，使每只家兔隔日吸入1.5X108CFU/ml的菌懸液1.5ml，35天后停止噴霧吸入操作。對照組用同樣方法使家兔吸入l.5ml無菌生理鹽水。

④處理后病程動態(tài)觀察及監(jiān)測：處理后定期觀察動物的狀態(tài)、體重、體溫及血象變化。噴霧吸菌前所有兔行胸部CT掃描排除有病變兔，接種后隔日一次將所有當(dāng)時存活的家兔CT掃描觀察病變。采用Sensation 16層螺旋CT機(jī)。使用兒童頭部掃描SFOV，螺旋掃描，床進(jìn)15mm/周，動物俯臥位，頭先進(jìn)；掃描條件：120KV,200mA；DFOV選擇100-120mm；掃描模式：1.0mm×16；肺算法(60)和標(biāo)準(zhǔn)算法重建（40）；常規(guī)層厚：3mm。

⑤病理學(xué)觀察：實驗組家兔均待其自然死亡，最后處死對照組家兔。剖胸取出肺制作病理切片，行HE染色鏡下觀察。實驗組兔肺標(biāo)本行肺組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)鑒定。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

2.1 存活時間 實驗組動物存活時間21-38天不等，平均存活時間為24.9天。有2只兔麻醉意外死亡，其余兔自然死亡時均形成不同程度的綠膿桿菌肺部感染。

2.2 觀察項目 A組新西蘭兔早期有明顯寒顫、發(fā)熱、喘息急促、亢奮恐慌，后期出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)粗糙黯淡、營養(yǎng)狀態(tài)差，平均體重下降明顯。B組新西蘭兔未見明顯異常。經(jīng)耳緣靜脈采血送檢實驗室檢查，A組新西蘭兔經(jīng)處理后外周血白細(xì)胞總數(shù)顯著升高，B組未見明顯改變。

2.4 胸部CT掃描 A組胸部CT出現(xiàn)斑片狀模糊影、支氣管充氣征、片狀實變、結(jié)節(jié)影、胸膜增厚等肺部感染改變，少數(shù)出現(xiàn)支氣管擴(kuò)張(圖1、2)。B組胸部CT未見明顯異常。

2.5 肺組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)鑒定 A組兔死亡后取病變肺組織進(jìn)行勻漿，于普通瓊脂培養(yǎng)基37℃上細(xì)菌培養(yǎng)24小時后，根據(jù)培養(yǎng)、形態(tài)及生化特性可鑒定致病菌為綠膿桿菌（圖3）。

2.6 病理學(xué)觀察

A組：吸入PA菌液后第21-28天死亡家兔肺臟表現(xiàn)有充血水腫，體積增大或正常，表面可見結(jié)節(jié)樣膿腫灶及出血點，部分可見胸腔積液(圖4)。第28天-35天死亡家兔的肺臟出血及膿腫灶減小，部分出現(xiàn)空洞性病變。第36后死亡的家兔肺臟體積減小，質(zhì)地輕度變硬(圖5)。A組HE染色后鏡下可見較多桿樣細(xì)菌菌落，部分成對或短鏈狀排列（圖6）。第21-28天肺泡腔內(nèi)大量出血、滲出，中性粒細(xì)胞浸潤、肺組織內(nèi)小膿腫形成，肺泡壁小血管擴(kuò)張充血（圖7）。第21-28天有肺組織實變伴周圍肺氣腫（圖8）、細(xì)支氣管壁炎細(xì)胞浸潤，部分纖毛倒伏、脫落的表現(xiàn)。第36天后死亡兔的肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主（圖9）。

B組：吸入無菌生理鹽水的對照組動物，肺臟大體標(biāo)本外觀無異常，鏡下細(xì)支氣管以及肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出。但是其中有2只肺間質(zhì)內(nèi)少到中量炎細(xì)胞浸潤。

討 論

醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的病原微生物以革蘭陰性桿菌為主（占50-70%），國內(nèi)外報道均以銅綠假單胞菌綠占首位[2]。銅綠假單胞菌（又稱綠膿桿菌）屬于條件致病菌，廣泛存在于濕潤的自然環(huán)境、機(jī)體體表及與外界相通的腔道內(nèi)，可在人體呼吸道、會陰部、 腋窩等處定植。機(jī)械通氣患者的下呼吸道、燒傷患者的皮膚、使用廣譜抗生素治療患者的黏膜皮膚等處都可有PA的定植[3]。由于該細(xì)菌表面有一層生物被膜，不易被吞噬細(xì)胞吞噬和抗生素抗生素滲透殺滅，且綠膿桿菌天然有染色體介導(dǎo)的多重耐藥特性，在使用抗菌藥后易發(fā)生獲得性耐藥，是下呼吸道感染難治性常見致病菌[4]。院內(nèi)感染患者基礎(chǔ)疾病較多，免疫力低下，加上氣管切開、插管、機(jī)械通氣和慢性阻塞性肺部疾病等造成的支氣管粘膜纖毛機(jī)制缺陷、功能不全的因素，造成黏附于上皮細(xì)胞的綠膿桿菌不能被有效地捕獲或趨送，為綠膿桿菌的長期定植創(chuàng)造了條件[5]。一旦發(fā)生定植就不易清除，可形成慢性炎癥。

目前肺部感染動物模型的肺部細(xì)菌接種常見方法有氣管切開術(shù)注入、氣管插管注入、霧化吸入、經(jīng)皮氣管穿刺注入、經(jīng)鼻咽滴入等方法[6,7]。Cash等[8]學(xué)者首先報道了小鼠肺部銅綠假單胞菌慢性感染模型。他們將小鼠氣管切開后，進(jìn)行插管注入銅綠假單胞菌的瓊脂包裹體，成功地將細(xì)菌接種至小鼠肺部造成感染。有學(xué)者使用免疫抑制小鼠氣管插管接種粘液型PA菌，發(fā)現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)下PA菌能導(dǎo)致多器官嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)[9]。國內(nèi)有學(xué)者曾采用霧化吸入法對老齡家兔反復(fù)感染綠膿桿菌，建立了家兔穩(wěn)定的慢性綠膿桿菌肺部感染模型[10]。但是氣管切開易造成傷口感染、出血較多等并發(fā)癥，氣管插管有創(chuàng)傷性風(fēng)險且操作相對復(fù)雜，經(jīng)皮氣管穿刺注菌的準(zhǔn)確定位一定程度上依賴于操作手法嫻熟與否。操作易造成其他病原菌混合感染并且術(shù)后動物生存時間較短。考慮到上述方法的創(chuàng)傷性、操作性，而本研究使用免疫正常的新西蘭兔，通過經(jīng)鼻噴霧吸入方式接種細(xì)菌，更安全、真實的模擬了綠膿桿菌呼吸道感染的自然途徑與急慢性病程，建立了家兔綠膿桿菌肺炎急慢性病程演變模型，并以影像學(xué)、病理學(xué)及病原微生物學(xué)三方面作為造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)。

本研究結(jié)果表明，接種PA菌懸液后，多數(shù)動物早期出現(xiàn)了諸如高熱、外周血白細(xì)胞總數(shù)升高的急性細(xì)菌感染癥狀和出血、肺水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、膿腫灶形成的病理改變。隨著細(xì)菌的反復(fù)接種，逐漸出現(xiàn)較多的慢性炎癥及在慢性炎癥基礎(chǔ)上急性發(fā)作的病理改變。停止吸菌后這種慢性炎癥改變長時間持續(xù)存在，出現(xiàn)非可逆性病理變化的原因可能是PA菌可能以生物被摸的形式長期存活于呼吸道和肺組織表面，與有關(guān)文獻(xiàn)報道的臨床情況相符。病理鏡下觀察顯示，吸入PA菌液后第21-28天肺部急性炎性病理改變，35天后以慢性炎癥病理變化為主。肺組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明家兔肺部感染的致病菌可定性為綠膿桿菌。在肺炎早期排查、輔助定性診斷、病程監(jiān)測及預(yù)后判斷中影像學(xué)起著重要作用，本研究中吸菌后第7天實驗組1號兔胸部CT可見雙上肺有明顯的斑片狀密度增高影，并見支氣管充氣征，從而說明CT對家兔綠膿桿菌肺炎的早期診斷是有價值的[11,12]。

本實驗通過采用噴霧吸入方法建立了家兔綠膿桿菌肺炎模型，并以影像學(xué)、病理學(xué)及微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，證實了綠膿桿菌能在新西蘭兔體內(nèi)造成急慢性感染病程中相應(yīng)的病理改變，與在人體的致病機(jī)制有明顯的相似性，因此可以用于綠膿桿菌肺部感染的發(fā)病機(jī)制、病理改變、藥物療效觀察以及診斷、治療的研究。

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