復合染料在嗜酸性粒細胞計數中的應用

李云 郭書俠 董蕤

嗜酸性粒細胞計數臨床常見的是直接計數、涂片白細胞分類計數和血球計數儀分類計數3種方法。但是臨床上為了解疾病進展過程，需要動態觀察嗜酸性粒細胞的變化，往往采用嗜酸性粒細胞直接計數。目前嗜酸性粒細胞直接計數方法很多，全國臨床檢驗專業委員會推薦的Hinkemann液［1］為經典嗜酸性粒細胞計數稀釋液，它與報道的稀釋液相比，各有優缺點。筆者曾報道過2種嗜酸性粒細胞計數稀釋液。文獻報道的嗜酸性粒細胞計數稀釋液都用的是單個染料，為此我們在工作中，根據染料的特點，嘗試用復合染料配制稀釋液，其目的是探索一種具有細胞染色與背景相差大，便于觀察，減少誤差，提高工作效率，為臨床提供及時、準確的結果。我們運用溴甲酚綠和甲基紅配制稀釋液作嗜酸性粒細胞計數稀釋液，在臨床實踐2年，計數結果比較準確，令人滿意，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 Hinkemann液:按《全國臨床檢驗操作規程》［1］配制。復合染料計數稀釋液:稱取溴甲酚綠18 mg、甲基紅12 mg溶于50 ml 0.9%氯化鈉溶液中，再加入0.6 ml TritonX-100，加0.9%氯化鈉溶液至100 ml。

1.2 方法 嗜酸性粒細胞直接計數:在試管中加入稀釋液0.38 ml，取患者末梢血(或 EDTA.2K 抗凝全血)0.02 ml，混勻，5 min后沖入計數池，靜置3～5 min，用低倍鏡計數，鏡下嗜酸性粒細胞被染成綠色，其他未被破壞的細胞幾乎不著色。計數兩計數室10個大方格內嗜酸性粒細胞數。計算:嗜酸性粒細胞/L=10個大方格內嗜酸性粒細胞數×20×106。

2 結果

2.1 對比試驗 我院取門診和住院109例患者的EDTA.2NA抗凝全血，分別用Hinkemann液(Y)與復合染料稀釋液(X)進行嗜酸性粒細胞計數，2種稀釋液計數結果差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。其相關系數0.993，相關方程 Y=0.858 X+6.2。

表1 109例復合染料稀釋液與Hinkemann液計數值比較×106，±s

表1 109例復合染料稀釋液與Hinkemann液計數值比較×106，±s

復合染料稀釋液 Hinkemann液232±136 229±128

2.2 鏡下比較 Hinkemann液背景顏色為紅色，嗜酸性粒細胞被染成桔紅色;復合染料稀釋液為酒紅色，加入抗凝全血后變紫色，嗜酸性粒細胞被染成綠色，它與背景顏色反差大，它比Hinkemann液將嗜酸性粒細胞被染成桔紅色更有利于辨認。

2.3 著色時間比較 將稀釋液與抗凝全血混合后，分別在60 s、120 s 、180 s 、240 s、270 s、300 s進行直接計數，Hinkemann液在270 s后嗜酸性粒細胞被染成桔紅色，復合染料稀釋液在120 s后嗜酸性粒細胞被染成綠色。

2.4 著色穩定時間比較 將109例計數完的標本分別在1 h、4 h、8 h再進行直接計數(表2)，Hinkemann液在1 h時計數與5 min時計數結果差異有統計學意義(P＜0.05)。到4 h時計數結果更低，計數無意義。而復合染料稀釋液在1 h、4 h時計數與Hinkemann液5 min時計數結果差異無統計學意義(P＞0.05)，在8 h時計數與Hinkemann液5 min時計數結果差異有統計學意義(P＜0.05)，說明復合染料稀釋液與全血作用后4 h后仍可以計數報告。

表2 109例復合染料稀釋液與Hinkemann液在不同時段計數值比較106×xˉ±s

2.5 試劑保質期比較 Hinkemann液使用1個月后，嗜酸性粒細胞著色淺或整個嗜酸性粒細胞不完全著色，需重新配制。復合染料稀釋液使用1年后，嗜酸性粒細胞著色仍然與新配制的一樣。

2.6 重復性試驗 用復合染料稀釋液進行嗜酸性粒細胞計數25次重復試驗，±S=(254±61)×106，CV=2.4%。

3 討論

目前，報道嗜酸性粒細胞計數稀釋液使用的染料有很多種，如:伊紅、溴甲酚紫、溴甲酚綠、溴酚藍［2］等。這些都是單個染料，我們嘗試運用復合染料溴甲酚綠和甲基紅，利用它的細胞著色與背景反差較大，它的變色pH值5.1，顏色由酒紅色變綠色，嗜酸性粒細胞被染成綠色，背景為紫色，這樣的顏色比較直觀，一看就一目了然。溴甲酚綠和甲基紅按3∶2比例配制，我們分別取溴甲酚綠45 mg/L和甲基紅30 mg/L、溴甲酚綠90 mg/L和甲基紅60 mg/L、溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L、溴甲酚綠300 mg/L和甲基紅200 mg/L四種濃度的進行配制，發現濃度大于溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L，背景綠色太深，不便于對嗜酸性粒細胞觀察;濃度小于溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L，背景綠色很適合，便于對嗜酸性粒細胞辨認，但染色時間要延長。為了克服上述缺點，我們采用溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L的濃度，不但嗜酸性粒細胞容易辨認，染色時間也較短。由于我們使用了表面活性劑TritonX-100，它能加速染料溶解;增強染料對細胞的滲透作用，從而使細胞著色加快。TritonX-100的濃度為0.6%［3］時，只破壞除嗜酸性粒細胞以外的細胞，嗜酸性粒細胞幾乎不受影響。本稀釋液是等滲的，有利于嗜酸性粒細胞不被破壞，因而能長時間保留著色的樣本。本稀釋液沒使用揮發性試劑，這樣稀釋液保質期就相對較長，使用1年之久，仍效果很好。總之本法具有細胞著色與背景反差大，便于辨認，著色時間短，著色穩定時間長，試劑保質期長等優點。易于推廣。

1 葉應嫵，王毓三，申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規程.第3版.南京:東南大學出版社，2006.136.

2 李云，郭書俠.溴酚藍在嗜酸性粒細胞計數中的應用.現代檢驗醫學雜志，2007，22:34.

3 幸建英，尹玲，王學風.TritonX-100在嗜酸性粒細胞計數中的應用.陜西醫學檢驗，1996，11:50.