Survivin和Caspase-3蛋白表達與食管鱗癌放療療效的關系

郝輝 李娟 李亞輝

近年來隨著分子生物學的發展，使我們能夠從蛋白水平、分子水平深入認識食管癌的發生、發展和預后。存活素(Survivin)是近年研究較多的凋亡抑制蛋白，在大多數人類腫瘤中其表達增多，與腫瘤細胞的凋亡、增殖、血管生成及其預后和耐藥性的產生密切相關［1－3］。半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)則是涉及細胞凋亡的最關鍵的蛋白酶［4］，在Caspase級聯反應中，直接介導下游的凋亡效應。故本研究通過檢測56例食管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白的表達，分析其表達的相關性、與食管癌臨床分期及預后的關系，擬為臨床治療提供有益的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇河北醫科大學第四醫院2010年1月至2011年1月放療前病理證實為食管鱗癌的內窺鏡活檢標本56例，全部患者均接受根治性放射治療，放療前后無其他輔助治療，放療采用6MV-X線直線加速器，腫瘤總劑量54～68 Gy，中位劑量60 Gy，2 Gy/次，1 次/d，5 d/周。其中男34 例，女22 例;年齡50～74歲，中位年齡65歲;胸上段10例，胸中段38例，胸下段 8例;病變長度≤5.0 cm 14 例，5.1 ～7.0 cm 20 例，7.1 ～10.0 cm 18例，＞10.0 cm 4例。依據2002年UICC食管癌國際 TNM 分期標準:全組患者 T1、T2、T3、T4 期分別為 2、38、14、2例;N0、N1期分別為38、18例;臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為2、30、18、6 例。

1.2 檢測方法 采用免疫組化SP法，1∶50濃度稀釋的鼠抗人Survivin單克隆抗體，1∶75濃度稀釋的鼠抗人Caspase-3單克隆抗體及IgG二抗工作液、SP試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。染色步驟參照試劑說明書完成。標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續切片，HE染色。

1.3 判斷標準 光鏡下觀察閱片，雙盲法計數陽性細胞，5個高倍視野(×200)計數取均值。Survivin陽性表達為胞漿或胞膜呈棕黃色顆粒，按Cai-De參考標準［5］:每個視野中均無著色細胞者或陽性細胞數＜25%者為陰性(－)，陽性細胞數≥25%者為陽性(+)(圖1)。Caspase-3陽性表達為胞漿內出現棕黃色顆粒散在或彌漫片狀分布，按Iseki標準［6］，根據 Caspase-3染色強弱及陽性細胞數兩個方面綜合判斷Caspase-3標記指數:a染色強度(0=無，1=弱，2=中，3=強);b陽性細胞數(0=無陽性細胞，1=陽性細胞數＜25%，2=陽性細胞數25% ～50%，3=陽性細胞數 ＞50%)，a、b相加的綜合得分即為Caspase-3陽性指數。用Caspase-3陽性指數大小來表示Caspase-3表達的高低:a+b得分為0～1，則陽性指數為0;a+b為2，則陽性指數為1;a+b為3，則陽性指數為2;a+b為4～5，則陽性指數為3;a+b為6，則陽性指數為4。綜合記分＜2為陰性表達(－)，≥2為陽性表達(+)。見圖2。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，蛋白表達指標之間及其與部分臨床病理因素之間的相關關系采用Spearman等級相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放射治療后近期療效評價 放射治療后達到完全緩解者12例，完全緩解率(CR)為21.4%，部分緩解者44例，部分緩解率(PR)為79.6%，總有效率100%。療后1年生存率61.4%，中位生存期14個月。觀察期內已死亡16例，占28.6%(16/56)，其中復發7例，轉移4例，嘔血4例，心臟病1例。Survivin和Caspase-3蛋白表達對食管癌近期療效無明顯影響。

2.2 Survivin和Caspase-3蛋白表達及其與預后的關系 56例食管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白表達的陽性率分別為28.57%(16/56)、53.57%(30/56)，兩者蛋白表達呈負相關(r= －0.549，P=0.002)。

Kaplan-Merier單因素分析結果顯示:T分期、臨床分期、病變長度、Survivin和Caspase-3蛋白表達均與患者預后相關，而性別、年齡、腫瘤部位、組織學分化程度與預后未顯示出明顯相關性。Survivin陰性表達者預后好于陽性表達者，Caspase-3陽性表達者預后好于陰性表達者(P ＜0.05)，見圖3、4，表1。

2.3 食管癌臨床分期與預后的關系 依據2002年UICC食管癌國際TNM分期標準，對56例食管癌患者進行臨床分期，T1～2期40例患者預后明顯好于T3～4期16例患者(P=0.001)(圖5)。N分期對預后生存未顯示出統計學差異。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期32例患者較Ⅲ～Ⅳ期24例患者預后好(P=0.013)(圖 6)。

2.4 多因素生存分析 將性別、年齡、病變長度、部位、淋巴結轉移狀態、照射劑量、病理類型、T分期、N分期、臨床分期及Survivin和Caspase-3蛋白表達進行Cox多因素分析顯示:Survivin蛋白表達、T分期、N分期與食管癌預后密切相關，Survivin蛋白陽性表達者及T、N分期較晚者預后差。見表2。

圖1 Survivin蛋白在食管鱗癌中陽性表達(HE×200)

圖2 Caspase-3蛋白在食管鱗癌中陽性表達(HE×200)

3 討論

圖3 Survivin蛋白表達與食管癌患者預后的關系

圖4 Caspase-3蛋白表達與食管癌患者預后的關系

圖5 T分期與食管癌患者預后的關系

圖6 臨床分期與食管癌患者預后的關系

表1 不同病理參數與食管癌患者預后的關系

表2 多因素分析對食管癌患者預后的影響

凋亡的抑制蛋白因子(inhibitur of apoptosis protein，IAP)是一類抑制凋亡的調節分子，其成員Survivin是近來發現的凋亡抑制基因，以細胞周期依賴的形式在G2/M期高表達，其過表達可促進有絲分裂致使細胞異常增殖［7］。Caspase蛋白酶又名半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡的核心，根據在細胞凋亡級聯反應中的作用位置可分為:在上游調控其他Caspase活化的始動Caspase(Caspase-1，2，4，5，8，9，10)和下游直接介導凋亡的效應Caspase(Caspase-3，6，7，14)，Survivin 可通過直接或間接作用于Caspase家族，從而阻斷細胞的凋亡過程［8］。

近年來研究表明，Survivin在多種惡性腫瘤中高表達，而且其表達程度與腫瘤的發生、發展和預后密切相關［6］。Kato等［9］采用RT-PCR技術檢測了51例食管癌中Survivin mRNA表達，顯示癌組織中Survivin陽性表達率為70.9%，并且Survivin的表達與患者術后生存期顯著相關，高表達者生存期短，提示Survivin表達增加有可能為判斷食管癌預后的指標之一。Sarela等［10］在114例大腸癌的研究中發現，Survivin mRNA在腫瘤中表達陽性率高于癌旁組織，提示Survivin的表達在大腸癌的發生中有一定作用，同時Survivin的表達也與Ⅰ～Ⅲ期大腸癌患者的生存狀態顯著相關，低表達者生存期長。本研究亦顯示陽性表達組預后差，這與多數研究結果一致。說明Survivin蛋白表達可以抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖，有可能成為食管癌預后不良的標志物。

Jiun-Yi等［11］采用免疫組化技術檢測了40例食管癌手術標本Caspase-3表達，陽性表達率60%，5年生存率25%，陰性表達率40%，5年生存率6%(P=0.02)，多因素分析:腫瘤分期、分化程度、Caspase-3表達均可作為預后因素，推測Caspase-3蛋白表達可作為獨立的評價食管癌預后良好的指標。陳洪雷等［12］應用免疫組化技術研究大鼠肺鱗癌Caspase-3蛋白表達水平與其細胞增殖間的關系，發現大鼠肺鱗癌Caspase-3陽性表達率44.12%，顯著低于對照組正常大鼠支氣管黏膜上皮細胞(P ＜0.01)及癌前病變組(P ＜0.05)，有可能Caspase-3參與了正常支氣管黏膜上皮細胞的發育、轉化及細胞凋亡過程的調節。本研究單因素分析亦顯示Caspase-3陽性表達者預后差，與上述文獻報道結果一致。Caspase-3缺失表達阻斷了Caspase家族凋亡途徑的下游效應因子，抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞生長，從而賦予腫瘤細胞惡性增殖的生物學行為，Caspase-3蛋白表達可作為判斷食管癌預后的指標。

本研究結果顯示，隨著Survivin在食管癌組織中表達量的升高或降低，Caspase-3的表達量呈升高或降低趨勢，通過直線相關分析可以看到二者呈負相關，更證實了Survivin通過抑制Caspase活性，阻斷細胞凋亡，故聯合檢測兩者蛋白有望提高判斷預后的價值。

雖然Survivin和Caspase-3在食管癌組織中的表達與食管惡性腫瘤的生物學行為和臨床行為的關系及其作用機制尚不十分明了，但通過檢測兩者蛋白在食管癌中的表達，可能為臨床治療方案的選擇和放射治療療效的評估提供一個參考標準。隨著分子生物學研究的深入，多基因聯合的基因治療將會為食管惡性腫瘤的治療開辟一個新的領域。

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8 Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptoric protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7.Biochemistry，2001，40:1117-1123.

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12 陳洪雷，刁路明，陳福春，等.大鼠肺鱗癌Caspase-3基因表達水平與其細胞增殖核關系的研究.中國肺癌雜志，2002，5:440-443.