基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的研究

康麗菲 朱桂云 李秀武 許志明 李曉霞 安曉穎 劉娜

目前，用于結核分枝桿菌耐藥性的檢測方法主要以培養為基礎的絕對濃度法或比例法，需要2～3個月才能得到結果，延誤了患者及時準確用藥，因此不能完全滿足臨床需要。創建快速、簡便、準確的檢測方法對臨床治療有積極意義。基因芯片技術正是為了滿足這種需求，用于結核分枝桿菌耐藥性檢測，對輔助用藥有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我院臨床診斷結核病標本21例，包括痰13例，肺泡灌洗液6例，傷口分泌物2例。均經過培養得到分離菌液。

1.2 儀器與試劑 ExtractorTM36核酸提取儀，Hybset基因微陣列芯片雜交盒BioMixerTMII，PCR擴增儀TC-25/H，離心機和離心干燥芯片的容器SliderWasherTM8，微陣列芯片掃描儀Lux-Scan 10K-B，基因芯片(利福平檢測rpoB基因，異煙肼檢測katG和inhA基因)及洗液SSC和SDS，核酸提取液，PCR擴增試劑1、2、3，雜交緩沖液，均購自北京博奧生物有限公司。

1.3 方法 痰及肺泡灌洗液樣本處理:向盛有痰樣的無菌盒中加入1～2倍4%NaOH，震蕩混勻，15～20 min后加入pH值6.8磷酸緩沖液混勻，離心后去上清，沉淀再加入0.5～1 ml磷酸緩沖液混勻，接種，培養。分泌物樣本處理:加入1～3倍體積4%H2SO4，混勻，靜置20～25 min，接種，培養。所有標本進行細胞培養后，一部分繼續做藥敏試驗檢測，一部分直接做基因芯片檢測。培養后基因芯片技術檢測的過程:培養后，吸取≥1個麥氏濁度的菌懸液10～20 μl，于含核酸提取液的核酸提取管中，使用核酸提取儀快速震蕩5 min，95℃水浴5 min，5 000 r/min離心1 min，得到的核酸擴增，每個樣品進行3管PCR反應，將 PCR 擴增試劑 1、2、3 分別按 18 μl/管分裝于200 μl離心管或八連管中，再加入模板DNA各2 μl于3管中，進行擴增(擴增程序37℃ 10 min 1個循環，94℃ 10 min 1個循環，94℃ 15 s→ 60℃ 30 s →72℃ 40 s，45 個循環，94℃30 s→72℃60 s，10個循環，72℃ 7 min 1個循環，4℃ 1個循環)，(PCR產物1為對照產物，PCR產物2為rpoB基因的擴增產物，與利福平微陣列相對應，PCR產物3為KatG基因及inhA基因啟動子的擴增產物，與異煙肼微陣列相對應)。

將雜交緩沖液9 μl/管，分裝于2管中，將PCR產物1和2各3 μl放于雜交緩沖液的管中(雜交反應混合物R檢測利福平)，PCR產物1和PCR產物3各3 μl放于雜交緩沖液的另一管中(雜交反應混合物H檢測異煙肼)，將雜交反應混合物加熱至95℃，再變性5 min后立即放于冰水混合物中3 min。提前向雜交盒中加入200 μl的蒸餾水，放好芯片及蓋片預熱50℃。將雜交反應混合物從冰浴中取出，經雜交盒蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應物，微陣列1和3加入雜交反應混合物R，微陣列2和4加入雜交反應混合物H，立即把密封好的雜交盒放入雜交儀中50℃，120 min，再進行芯片洗滌(洗液Ⅰ:依次將20*SSC、蒸餾水、10%SDS，按照 10∶88∶2的比例混合，洗液Ⅱ:將20*SSC、蒸餾水按1∶99的比例混合，洗液Ⅰ清洗1次，30℃，120 s，洗液Ⅱ清洗2次，30℃，60 s)與甩干，最后上機掃描。

2 結果

2.1 利福平耐藥檢測 21例中，利福平rpoB基因10例突變型(圖1)，10例野生型(圖 2)，1例無法判讀?？偼蛔兟?7.6%，其中9例為531位點的(C-T)突變，1例526位點的(CG)突變。與藥敏實驗的符合率為81.0%。利福平的11例耐藥株中，基因芯片檢測8例為突變型，突變率72.7%，在利福平的10例敏感株中，基因芯片檢測2例為突變型，突變率20.0%。

2.2 異煙肼耐藥檢測 21例中，異煙肼基因有6例突變型，15例野生型(圖3)，總突變率28.6%，其中4例為KatG 315(G-C)突變(圖4)，占 66.7%，2例為 inhA-15(C-T)突變(圖 5)，占33.3%。與藥敏實驗的符合率為90.5%。在異煙肼的6例耐藥株中，基因芯片檢測5例為突變型，突變率83.3%，在異煙肼的15例敏感株中，基因芯片檢測1例為突變型，突變率6.7%。

圖1 利福平ropB突變

圖2 利福平野生型

圖3 異煙肼野生型

圖4 異煙肼katG突變

圖5 異煙肼inhA突變

3 討論

結核病的臨床診療中，利福平和異煙肼是抗結核的一線藥物，但近幾年隨著結核病的發展，結核分支桿菌對藥物的抗藥性逐漸增強。結核分支桿菌的耐藥性是由相關基因突變引起的。因此一線藥物的耐藥性檢測對于臨床治療結核病有積極意義。傳統藥敏實驗檢測結核耐藥有一定的缺陷，如耐藥性的界限不統一，時間較長，結核菌培養期間可能發生基因突變等。難以滿足真正快速檢測的需要。基因芯片技術能快速準確的檢測結核桿菌耐藥性，將檢測時間2～3個月縮短到2 d。

基因芯片是指將大量不同的生物信息分子(如寡核苷酸、DNA或cDNA探針等)以高度密集的方式，有序地固定在固相支持物(玻璃片)上形成微陣列。當熒光標記的靶分子與芯片上的探針分子結合后，用激光共聚焦熒光掃描對熒光信號的強度進行檢測，從而對雜交結果進行量化分析。

結核分枝桿菌利福平耐藥主要是由于其作用靶分子RNA多聚酶β亞單位的編碼基因rpoB突變所致，且突變一般發生在507位至533位27個氨基酸密碼子組成的區域內［1］。其作用機制是通過與結核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位結合，干擾轉錄的開始和RNA的延伸。其中最常見的突變位點是531位絲氨酸和526位組氨酸［2］，并且531位點突變＞526位點位點［3］。本實驗中利福平的檢測基因為rpoB，21例樣本中有10例突變，總突變率為47.6%，與藥敏實驗的符合率為81.0%，低于何敏等［4］的研究結果，其符合率為94.29%。其中531位點突變占90.0%，526位點突變占10%，531位點突變明顯高于526位點。11例利福平耐藥株中突變率為72.7%，10例利福平敏感株中突變率為20.0%，而崔振鈴等［5］研究發現94株利福平耐藥株中突變率為81.9%，46株利福平敏感株中突變率為13.0%。1例無法判讀，可能存在利福平新的突變位點。

結核分枝桿菌異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因katG及烯?；€原酶編碼基因 inhA和 ahpC(羥基過氧化氫還原酶)基因的啟動子的缺失或突變有關，其中 katG完全缺失或點突變是最主要的耐藥機制，最常見的突變位點是315 位 Ser［6］。

本實驗中檢測異煙肼基因突變位點KatG 315和inhA-15，21例樣本中總突變率為28.6%，而低于謝士達等［7］的研究結果，其異煙肼耐藥總突變率為35.5%。本實驗中KatG 315突變占66.7%，稍高于與謝士達的結果(62.5%)。大致驗證了異煙肼耐藥主要是KatG突變。本實驗中基因芯片與藥敏實驗的異煙肼符合率為90.5%。

總之，用基因芯片檢測結核分枝桿菌耐利福平和異煙肼的基因突變，快速，準確，敏感性高，特異性強。對臨床及時準確進行抗結核治療具有重要的臨床意義。

1 Garcia de Viedma D，del Sol Diaz Infantes M，Lasala F，et al.New realtime PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and highlevel isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2002，40:988-995.

2 黃海榮，金奇，陳曦，等.中國結核分枝桿菌rpoB基因突變特點.中華結核和呼吸雜志，2001，24:231-235.

3 丁金風，楊渝珍，張先恩主編.基因分析核生物芯片技術.第1版.武漢:湖北科學技術出版社，2004.294.

4 何敏，曾爾良，鄭艷燕，等.利用基因芯片檢測結核分枝桿菌及其利福平耐藥性的研究.中華流行病學雜志，2003，24:385-388.

5 崔振鈴，景奉香，胡忠義，等.基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究.中華結核和呼吸雜志，2004，27:439-441.

6 李桂蓮，王擷秀，趙德福.結核分枝桿菌耐藥基因的研究進展.中國慢性病預防與控制，2006，14:377-379.

7 謝士達，劉永成，張鳳池，等.基因芯片技術快速檢測結核分支桿菌異煙肼、利福平耐藥性.臨床肺科雜志，2008，13:147-149.