稀土上轉換發光納米材料的制備及生物醫學應用研究進展

林 敏，趙 英，董宇卿，周麗宏，胡 杰，沙保勇，韓玉龍，陳詠梅，徐 峰，盧天健

(1.西安交通大學生命科學與技術學院 生物醫學信息工程教育部重點實驗室，陜西 西安 710049)(2.西安交通大學生物醫學工程與生物力學中心，陜西 西安 710049)(3.西安交通大學理學院，陜西 西安710049)

稀土上轉換發光納米材料的制備及生物醫學應用研究進展

林 敏1，2，趙 英1，董宇卿1，周麗宏1，胡 杰1，沙保勇1，韓玉龍1，陳詠梅3，徐 峰1，2，盧天健1

(1.西安交通大學生命科學與技術學院 生物醫學信息工程教育部重點實驗室，陜西 西安 710049)(2.西安交通大學生物醫學工程與生物力學中心，陜西 西安 710049)(3.西安交通大學理學院，陜西 西安710049)

熒光探針技術已經被廣泛應用于生物成像、生物標記、生物檢測、免疫分析等生物醫學領域。傳統熒光標記材料，如有機熒光染料、熒光蛋白和半導體量子點，目前面臨諸多應用局限，如發光強度不穩定、檢測靈敏度低、生物毒性高、自熒光強等。有鑒于此，人們開發了La系金屬離子摻雜的稀土上轉換發光納米材料作為新型生物標記材料，該材料受近紅外光激發后發出近紅外或可見光范圍內的高能量光子。這種帶有特殊光學性質及良好生物相容性的熒光標記材料克服了傳統熒光標記材料的缺點，從而成為材料科學與生物醫學交叉領域的研究熱點。綜述了稀土納米材料上轉換功能的特殊物理機制及其制備和表面修飾方法的研究進展。在此基礎上介紹了稀土上轉換納米材料在生物成像、檢測、載藥、即時診斷器件開發等生物醫學工程中的應用。

熒光探針;稀土納米材料;上轉換效應;制備;表面修飾;生物醫學應用

1 前言

有機熒光染料和熒光蛋白是最常用的體外成像造影劑，但其具有光穩定性低(光漂白、閃爍)、由發光峰寬導致的光譜重疊等問題，故在生物成像方面的應用受到很大局限［1-3］;作為熒光標記物，量子點具有光學穩定性好且發射帶寬窄的特點［4］，但量子點中含有Cd離子等有毒重金屬離子，對生物體有潛在的危害［5］。此外，無論是有機染料、熒光蛋白還是量子點，均存在一個難以克服的缺陷，即它們的激發光都處在紫外波段，在該波段的激發光下，生物體系中的核酸、多肽、氨基酸和蛋白質以及生物體組織等也會產生強烈的背景熒光，從而降低了檢測靈敏度［5-6］。近年來發展起來的La系金屬離子摻雜的稀土納米材料，具有獨特的上轉換光學性質，克服了上述缺點，顯示出獨特的優勢，如:①上轉換稀土納米材料所選用的無機質材料，化學穩定性好、材料毒性低，在生物體內不易形成聚集［5，7-12］;②在長時間激發光照射下發光依然非常穩定，無閃爍，不易光解和光漂白［7，13-14］;③ 上轉換稀土納米材料激發光源為980 nm的近紅外光，可有效避免生物樣品自發熒光的干擾和散射光干擾，進而提高檢測靈敏度［13，15-16］;④ 980 nm的激發光位于近紅外區，能量較低，對生物體組織的損傷很?。?7］;同時，由于生物體組織一般對該波長激發光的吸收很低，故近紅外激發光在生物組織內具有很深的穿透力，非常適合于體外或活體成像分析［5］;⑤ 通過調節所摻雜稀土元素的種類、溶度和基質材料，可在同一激發光下，實現多色上轉換發光，可用于多目標同時標記［5，18］。

由于稀土上轉換納米材料具有上述眾多優點，因此，在生物檢測、免疫分析和生物成像等方面，較之量子點及有機熒光染料都有著無法替代的優勢。隨著納米材料的制備及其表面修飾技術的發展，稀土上轉換納米材料在生物醫學領域具有不可限量的應用前景。本文綜述了稀土上轉換納米材料的發光機制及其常用的制備方法和表面修飾方法，并介紹了稀土上轉換發光納米材料在生物醫學領域的典型應用，如生物熒光成像、即時診斷器件開發、基于熒光共振能量轉移的檢測、藥物輸送，最后提出了在應用中亟待解決的問題。

2 上轉換發光機制

作為一種較為特殊的發光現象，上轉換效應通過吸收低能激發光子轉換為高能發射光子。但這并未違反能量守恒定律，因為高能量光子的發射是通過吸收多個低能量光子而產生的，這種過程稱為上轉換發光?？傮w而言，上轉換過程可歸結為以下3種激發方式［19］。

激發態吸收上轉換(Excitation State Absorption，

ESA) 同一個電子從基態能級經過連續雙光子或多光子吸收躍遷到能量較高的激發態能級的過程，并以光的形式釋放能量，形成上轉換發光，如圖1a所示，這是上轉換發光的最基本過程。

能量傳遞上轉換(Energy Transfer Upconversion，ETU) 這一過程一般發生在不同類型的離子之間，如圖1b所示。當敏化中心S和激活中心A的激發態和基態能級之間的能量差相同且兩者之間距離足夠近時，兩者之間可發生共振能量傳遞，使得A離子中的電子躍遷至更高的激發態能級，這種傳遞方式稱為能量傳遞過程。

光子雪崩上轉換(Photon Avalanche，PA) 首先是處于基態離子中的電子，通過非共振基態吸收作用達到激發態E1能級，然后通過共振激發態吸收過程，到達較高能級E2，隨后與鄰近的基態離子間發生交叉弛豫能量轉移(或離子間弛豫過程)，結果導致兩個離子到達中間能級E1。如此反復，最終導致E2能級的電子數隨時間呈指數型增加，稱作光子雪崩過程，如圖1c所示。

圖1 上轉換機制示意圖:(a)激發態吸收，(b)能量傳遞，(c)光子雪崩Fig.1 Schematic of upconversion mechanism:(a)excited state absorption，(b)energy transfer upconversion，and(c)photon avalanche

上述3種上轉換過程的發光效率有很大不同，其中ESA是效率最低的上轉換過程，而ETU過程是即時的且不受泵浦功率的影響，可提供高效率的上轉換發光(比ESA約高兩個數量級)。

3 稀土上轉換發光納米材料的制備方法

材料通常由基質材料、激活劑和敏化劑構成。要制備高效的上轉換發光材料，首先需要尋找合適的基質材料，基質材料本身不會因受到激發而發光，但能為激活離子提供適合的晶體場。激活劑可讓激發和發光發生在同一個離子上。敏化劑自身并不發光，但其強烈吸收外界能量后可有效地將能量傳遞給激活劑，從而增強激活劑的發光效率。

3.1 基質材料的選擇標準

對于基質材料，一般要求其晶格常數盡可能與摻雜離子匹配并且對入射光的吸收較低［19］。常用的基質材料主要有氧化物、氟化物和氯化物等［18，20-24］。就上轉換發光效率而言，若單從材料的聲子能量方面來考慮，一般認為氯化物 ＞氟化物 ＞氧化物，若僅考慮材料結構的穩定性，則氯化物 ＜氟化物 ＜氧化物。因此，基于實際應用需求，人們希望找到既有氯化物或氟化物那樣高的上轉換效率，又兼有類似氧化物結構穩定性的新基質材料。目前，常用的氟化物材料有:LaF4、YF4和NaYF4［25-28］。氧化物材料有:Y2O3和 Y2O2S［29］。

3.2 摻雜離子的選擇標準

稀土元素離子Ho3+，Nd3+，Tm3+，Er3+具有豐富的能級結構，由于4f能級的電子屏蔽作用，其能級壽命較長，有很高的上轉換效率，是目前研究較多的激活劑［19］。稀土離子Yb3+的激發波長是980 nm，與Er3+第一激發態的吸收能量一致，且吸收截面遠大于Er3+，吸收能量后可傳遞給Er3+，因而是一種很有效的敏化劑。加入 Yb3+后，Er3+的上轉換效率可提高1～2個數量級［30］。

3.3 制備方法

稀土上轉換納米材料具有優異的發光性能及廣闊的應用前景。為了制備性能優異的上轉換發光材料，人們嘗試了多種不同的合成方法，如高溫固相法、沉淀法、溶膠-凝膠法、微乳液法、水熱合成法等。判斷一種合成方法是否合適的關鍵，取決于如下因素:① 納米微粒的結晶度高;② 方法簡便、易操作且重復性好;③產物的粒徑、形貌均一，不產生團聚現象;④ 有較好的熱穩定性，產率高，發光效率高［31-33］。

以下簡單介紹3種最常用的合成方法。

3.3.1 沉淀法

沉淀法利用可溶性物質，在水溶液中進行化學反應，生成難溶物質，將其從水溶液中沉淀出來，然后再經過濾、洗滌、干燥、焙燒等工藝過程，得到稀土上轉換發光納米材料［34-35］。該方法的特點是:操作工藝簡單、成本較低、反應溫度低，適用于批量生產。但產物晶化程度較低是其主要缺點［34］。以NaYF4:Yb，Er的制備為例，沉淀法的產物一般為立方相NaYF4:Yb，Er，其上轉換發光效率較低，需經后續的煅燒處理才能得到上轉換發光效率較高的六方相NaYF4:Yb，Er［36］。采用沉淀法制備其他稀土上轉換發光納米材料，如Lu-PO4:Yb，Tm和YbPO4:Er，Tm，也需要后續的高溫煅燒處理［35］。

3.3.2 溶膠 -凝膠法

溶膠-凝膠法是將金屬醇鹽或無機鹽經水解直接形成溶膠(或經解凝形成凝膠)，然后使溶質聚合凝膠化，再將凝膠干燥、焙燒去除有機成分，最后得到產品，常用于制備氧化物基稀土上轉換納米材料，如YVO4:Yb， Er， Lu3Ga5O12:Er， BaTiO3:Er， TiO2:Er 和ZrO2:Er等［37-41］。溶膠 -凝膠法具有反應條件溫和、設備簡單、操作簡便、易于大規模生產等優勢，但存在反應條件不易控制、產物團聚嚴重、需要后續高溫熱處理等不足。

3.3.3 水熱合成法

水熱合成法主要是利用許多化合物在高溫高壓溶液中表現出如溶解度增大、離子活度增加等與在常溫下不同的性質，來制備稀土上轉換納米材料［34，42-44］。其優點是可直接得到結晶粉末，粒子純度高、分散性好，且形貌、粒徑可控制。與其他方法相比，水熱合成法最大的優越性在于:在反應物中加入PEI，PVP等，通過一次合成過程可同時實現稀土上轉換納米材料的制備及表面修飾［11，45］。但水熱合成法存在反應過程機制不清晰的問題。

4 稀土上轉換納米材料的表面修飾

近年來，人們雖然已采用多種方法制備了不同形貌、尺寸可控、粒徑均一的稀土上轉換納米材料，但仍難以獲得良好的水溶性和生物相容性，限制了其在生物醫學領域的應用，故需要在合成納米顆粒之后對其表面進行修飾。表面修飾不僅能增強稀土上轉換納米材料的發光效率，還可為其在生物醫學中的應用提供適當的功能。根據不同表面修飾的目的，對稀土上轉換納米材料進行表面修飾可分為表面鈍化和表面功能化兩類。

4.1 表面鈍化

稀土上轉換納米材料的發光效率比其相應的塊體材料的發光效率低［36］。這主要是由于納米量級顆粒表面摻雜離子的相對濃度較高，受表面雜質、配體以及溶劑引起的熒光猝滅，或能量通過非輻射的方式消散［36］。表面鈍化即在稀土上轉換納米顆粒外部包覆同質稀土層、二氧化硅層或聚合物層的方法，以便有效地抑制內部離子的激發能量轉移到納米顆粒的表面，從而提高上轉換發光效率。例如，在NaYF4:Yb，Tm納米顆粒表面修飾一層約2 nm厚未摻雜的NaYF4和聚丙烯酸后，上轉換發光效率提高近30倍;NaYF4:Yb，Er納米顆粒經過同樣修飾后，其上轉換效率提高近7倍［26］。KYF4:Yb，Er和NaGdF4:Er，Yb納米顆粒通過表面修飾后，其上轉換發光效率也有不同程度的提高［46-47］。

4.2 表面功能化

表面功能化即在上轉換稀土納米顆粒表面修飾一層或多層官能基團，使得修飾后的納米顆粒具有親水/疏水性或便于連接其他如蛋白質、DNA、抗體/抗原等以實現特殊的生物功能。常見的表面功能化方法有［48］:表面配體氧化法，表面配體交換法，聚合物包裹法，二氧化硅包覆法，層層自組裝包覆法。

4.2.1 表面配體氧化法

為了得到親水性納米顆粒，利用Lemieux-von Rudloff(KMnO4+NaIO4水溶液)試劑將稀土上轉換納米顆粒表面的油酸配體氧化成壬二酸配體，就可或得親水性羧酸功能化的稀土上轉換納米顆粒［49］。氧化過程對納米顆粒的相結構、組成、形貌和發光性能沒有明顯影響。羧酸基團的存在不僅使稀土上轉換納米顆粒具有良好的水溶性，而且可使其進一步和各類生物分子(例如鏈親合素)直接偶聯。但是，這種方法僅適用于本身不會被氧化、且表面配體含有碳碳不飽和鍵的稀土上轉換納米顆粒，例如表面有油酸或者亞油酸的稀土上轉換納米顆粒。

4.2.2 表面配體交換法

表面配體交換法主要采用配位能力較強、多功能有機配體來取代稀土上轉換納米顆粒表面配位能力較弱、疏水性有機配體，最終制備出具有親水性的稀土上轉換納米顆粒［50］。例如 Kumar等［51］采用 3-巰基丙酸，通過表面配體交換法置換納米顆粒表面的油酸，得到末端為羧基的可溶性稀土上轉換納米顆粒。這種方法的局限性在于很難確定配體交換的效率。

4.2.3 聚合物包裹法

聚合物包裹法是利用兩親性聚合物的疏水鏈和稀土上轉換納米顆粒表面的長烷基鏈之間的范德華力作用，包覆在納米粒子表面，再加上親水端的親水作用，形成一個疏水/親水的有機核殼結構［26］。這不僅解決了水溶性和官能團的問題，而且減弱了水對稀土上轉換納米顆粒的熒光猝滅效應。這種方法工藝相對較復雜。

4.2.4 二氧化硅包覆法

二氧化硅包覆法是利用硅烷前驅體的水解聚合，在稀土上轉換納米顆粒表面靠共價鍵作用包覆一層厚度可控的二氧化硅層［52］:采用St?ber法和反向微乳液法可分別包覆親水性和疏水性的納米粒子［53］。二氧化硅包覆后的稀土上轉換納米顆粒具有較好的水溶性和生物相容性，因而廣泛應用于稀土上轉換納米顆粒的表面修飾。然而，這種方法對工藝的要求較高，難以精確控制包覆層的厚度和形貌。

4.2.5 靜電吸引層層組裝包覆法(LBL)

LBL法首先在疏水的稀土上轉換納米顆粒表面吸附一層帶電聚合物，然后將其加入到帶異種電荷的聚合物溶液中，這兩類聚合物因帶有異種電荷而相互吸引;如此依次吸附，兩種聚合物可在納米顆粒的表面交替組裝成有機殼層［54］，通過改變吸附層數可調控有機殼層厚度，從而優化稀土上轉換納米顆粒在水溶液中的穩定性和在生物體內的相容性。此法操作較復雜，需反復洗滌，嚴格控制表面電荷，且聚電解質較為昂貴，實際推廣應用有一定困難。

5 稀土上轉換發光納米材料在生物醫學中的應用

La系金屬離子摻雜的稀土上轉換發光納米材料，具有獨特上轉換發光性質、光學性質穩定、對細胞的毒性小，且激發波長在近紅外區(980 nm)，對生物組織具有良好的穿透性且不會對組織、DNA、蛋白質等造成光傷害;同時還可避免背景自熒光，提高熒光信噪比，因此在生物成像、免疫分析、生物檢測和藥物輸送等方面有著廣闊的應用前景。以下舉例介紹幾種典型的生物醫學應用。

5.1 生物熒光成像

熒光探針在光學成像中的地位日顯重要，在藥理學、分子生物學、診斷學、細胞的實時成像及體內深層組織成像中的應用也越來越廣泛［55-57］。傳統的熒光材料需要較高能量的光子激發，如紫外光，而紫外光照射能造成組織的光損傷，更為重要的是，紫外光可被組織強烈吸收，因而在組織中的穿透能力有限，從而限制了傳統熒光材料在體內深層組織成像中的應用。而稀土上轉換納米材料能在近紅外光激發下，發出可見光，可很好地避免激發光對組織造成的損傷，且近紅外激發光的應用增加了光子在組織中的穿透極限。例如，Chatterjee等［5］比較了量子點和PEI包覆的NaYF4:Yb，Er納米材料在動物深層組織中的成像能力(如圖2所示)，發現PEI包覆的NaYF4:Yb，Er納米材料在深度為10 mm的組織內依然可見清晰的熒光;與此相比較，在大鼠足部半透明的皮膚組織下的量子點發出的綠色熒光已經非常微弱［5］。

5.2 即時診斷器件開發

即時診斷裝置(如側流免疫層析快速檢測試紙)可快速檢測傳染性病原體、腫瘤生物標記物和化學分析物。該類裝置不僅價格便宜，操作使用方便，而且消除了對昂貴大型儀器和熟練操作員的需求［58］。側流免疫層析快速檢測試紙是最常用的即時診斷裝置之一，依靠納米晶或其他膠體顆粒實現其檢測功能。雖然結果可以肉眼觀察，但由于缺乏靈敏度，特別是在傳染病初期、分析物濃度相對較低時，檢測試紙條的使用受到了限制。因此，需要進一步改進試紙條的設計，以提高檢測靈敏度。憑借快速的檢測速度(＜10 min)和極低的檢測極限(1 ng/μL)，稀土上轉換發光納米粒子在即時診斷器件開發應用中受到廣泛關注［59-61］。Niedbala等［59］設計了一個側流免疫層析快速檢測試紙，利用多色上轉換納米粒子(Y2O2S:Yb3+/Er3+)，根據熒光的顏色和位置成功地檢測到了唾液中的苯丙胺、甲基苯丙胺、苯環已哌啶和阿片制劑，如圖3所示。

圖2 大鼠活體熒光成像:量子點(QDs)被注射入大鼠足部半透明的皮膚處顯示微弱的綠色熒光(a);在背部(b)和腹部(c)不顯示熒光;注入到腹部皮膚下(d)，背部皮膚下(e)及大腿肌肉中(f)的PEI包覆的NaYF4:Yb，Er納米材料發出清晰的熒光。(a，b)中將量子點置于黑色背底作為對照。Fig.2 In vivo imaging of rat:quantum dots(QDs)injected into translucent skin of foot，show green fluorescence(a)，but not showing through thicker skin of back(b)or abdomen(c);PEI/NaYF4:Yb，Er nanoparticles injected below abdominal skin(d)，below skin of back(e)，or thigh muscles(f)showing luminescence，QDs on black disk in(a，b)are used as contrast

圖3 上轉換熒光技術側流免疫層析快速檢測試紙結構示意圖，容納多達12條不同的檢測線Fig.3 Structural diagram of upconversion fluorescence based lateral flow immunity chromatographic test paper，the architecture of the lateral flow strip is designed to accommodate up to 12 distinct test lines

5.3 基于熒光共振能量轉移的檢測

熒光共振能量轉移要求供體和受體之間的高效能量轉移，通常需要兩者間距離小于10 nm?；跓晒夤舱衲芰哭D移的粒子對以稀土上轉換納米粒子作為供體，依賴于耦合上轉換納米粒子和下轉換熒光團之間的熒光共振能量轉移:當兩者極為貼近時，近紅外光激發稀土上轉換納米粒子產生上轉換熒光發射，并由此激發下轉換熒光團產生熒光。利用這一原理，Zhang等［49］開發了高靈敏度、高特異性、基于上轉換熒光共振能量轉移的單鏈核酸生物探針，如圖4所示。該方法的原理是在兩段短鏈寡核苷酸上分別吸附上轉換納米粒子和熒光團，然后將其作為捕獲長鏈目標寡核苷酸鏈的探針。當目標核酸存在時，兩個探針都結合到各自的互補序列，這樣上轉換納米粒子和熒光團之間的間距足夠近，從而產生能量共振轉移。發射光譜的強度與供體-受體對的數目呈線性相關，即和目標寡核苷酸的濃度成正比。

5.4 藥物輸送

光動力學療法(PDT)采用光激活化學物質(光敏劑)，從而產生單線態氧，最終導致細胞死亡。用于激活光敏劑的激發光通常為在可見-近紅外波段，但對人體組織的穿透能力有限，故光動力學療法常常受到組織深度的限制。Zhang等［62］首次報道了將稀土上轉換納米材料應用于光動力學療法，他們將光敏劑和腫瘤靶向抗體附著到表面包裹有二氧化硅的NaYF4:Yb，Er納米顆粒上，并將該復合顆粒用于光動力學療法(圖5)。該納米顆粒載藥系統主要有3種作用:① 裝載光敏劑;②對腫瘤細胞的靶向作用;③把低能、組織穿透性好的激發光轉換成高能光子以激發光敏劑?；陬愃频脑?，研究者開發了不同的上轉換稀土納米材料載藥系統，應用于光動力學療法［63-67］。

6 結語

雖然針對稀土上轉換發光納米材料的研究尚處于起步階段，但已取得了令人矚目的研究成果，引發廣泛關注，該領域還有許多問題亟待解決，如小粒徑、高結晶度、分散均勻、具有較高穩定性和發光效率上轉換稀土納米材料的可控合成和表面改性方法;對細胞和活體組織的毒性以及在活體內的代謝情況;多功能生物醫學應用開發等。進一步探索和建立功能化稀土上轉換納米材料的制備和應用理論體系對拓寬稀土上轉換發光材料在生物醫學領域的應用范圍具有重大的科學意義和實用價值，相關研究將繼續成為化學、材料科學和生物醫學交叉學科領域的研究熱點。

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Progress in Synthesis and Biomedical Applications of Rare Earth Upconversion Luminescent Nano Materials

LIN Min1，2，ZHAO Ying1，DONG Yuqing1，ZHOU Lihong1，Hu Jie1，SHA Baoyong1，HAN Yulong1，CHEN Yongmei3，XU Feng1，2，LU Tianjian1

(1.The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering，Ministry of Education，School of Life Science and Technology，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China)(2.Biomedical Engineering and Biomechanics Center，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China)(3.School of Science，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China)

Fluorescent imaging technology has been widely used in bioimaging，biolabeling，biodetection，immunoassay and other biomedical applications.Traditional fluorescent materials，such as organic fluorescent dyes，fluorescent proteins and quantum dots，faces many limitations，such as low photostability，background autofluorescence，cytotoxicity and limited detection sensitivity.To address these issues，lanthanide(Ln)-doped upconversion nanoparticles(UCNPs)have been developed as a new class of fluorescent material.Such materials exhibit unique fluorescent property known as photon upconversion，providing tremendous advantages over conventional fluorophores for biomedical applications.This paper reviews recent advances in the synthesis of Ln-doped UCNPs and their surface modification，as well as their emerging applications in biomedicine.The future prospects of Ln-doped UCNPs for biomedical applications are also discussed.

fluorescentprobe;RE nanomaterials;photonupconversion;synthesis;surfacemodification;biomedical applications

TQ133.3;TQ422

A

1674-3962(2012)01-0036-08

2011-11-18

高等學校學科創新引智計劃項目(111計劃，B06024);國家杰出青年自然科學基金項目(10825210);國家重大國際(地區)合作研究項目(11120101002);國家自然科學基金海外青年學者合作研究基金(31050110125)

林 敏，男，1982年生，博士

徐 峰，男，1980年生，教授