體內組織工程構建小口徑人工血管的研究進展

王淑芳，鄭文婷，孔德領

(南開大學生命科學學院藥物化學生物學國家重點實驗室，天津300071)

體內組織工程構建小口徑人工血管的研究進展

王淑芳，鄭文婷，孔德領

(南開大學生命科學學院藥物化學生物學國家重點實驗室，天津300071)

小口徑血管在臨床上有很大需求，但小口徑血管再狹窄率很高。體內組織工程是改善小口徑血管功能、實現血管再生的有效手段。介紹了小口徑人工血管的國內外研究發(fā)展動態(tài)，詳述了作者實驗室在構建小口徑人工血管方面的設計思路和研究所取得的主要進展。研究包括支架材料結構設計與制備技術，支架材料表面功能化修飾，內皮祖細胞捕捉，血管平滑肌再生，抗凝血和促內皮細胞黏附，血管再生微環(huán)境的構建等。最后對小口徑人工血管研究尚需解決的科學問題和研究方向進行了討論。

人工血管;組織工程;支架制備;干細胞捕捉;內皮化;平滑肌再生;細胞外微環(huán)境

1 前言

小口徑血管在臨床上有很大需求，美國心臟協會2010年報道，每年大約有500 000冠狀動脈搭橋手術［1］，另外超過100萬的患者因嚴重的下肢缺血需要血管移植［2］。在我國每年也有大量需求。但如今在臨床上常用的大口徑血管材料(ID＞6 mm)ePTFE和Daron，如果作為小口徑血管材料，再狹窄率很高。在過去的20～30年間，小口徑人工血管的研究手段主要是組織工程。對材料表面進行抗凝血修飾，在植入體內之前，在材料表面種植內皮細胞，并借助生物反應器進行組織培養(yǎng)［3］。

然而，組織工程研究方法存在許多局限。在體外構建的小口徑血管在植入體內后常常出現內皮細胞層脫落、內皮細胞在短期內被取代、內皮細胞功能不全、血管再狹窄率高等問題。組織工程構建過程需要病人自體細胞的分離、體外擴增、與支架材料一起通過生物反應器長時間培養(yǎng)，發(fā)生細菌感染的幾率高，構建的組織工程血管不宜儲存和運輸、成本很高等，臨床應用的可操作性較差［4］。血管組織工程的研究開展這么多年來，還沒有小口徑血管材料的臨床實驗。因此，需要突破傳統(tǒng)的研究思路，尋求一種生產更為簡單、臨床應用的操作性更強的小口徑人工血管的研究方法。

近年來，在組織工程與組織再生領域，越來越多的學者提出“體內組織工程”的思路［5－6］。具體來說，就是強調對支架材料進行活性和功能修飾，使植入的支架材料在體內募集捕捉干細胞，誘導血管新生和干細胞分化與增殖，促進組織的迅速修復和再生，使組織構建在體內完成。與傳統(tǒng)組織工程研究手段不同之處，在于沒有細胞接種和體外培養(yǎng)，依靠材料調動人體自我康復能力，引導或誘導受損組織/器官再生。因此，體內組織工程材料的主要研究內容，是支架材料的結構設計與加工、材料的活性修飾與組織再生微環(huán)境構建。對于小口徑人工血管來說，支架材料的結構設計主要考慮材料的力學強度、順應性、孔結構和生物降解性，對支架材料的活性修飾，除了組織再生微環(huán)境修飾，更重要的是表面抗凝血修飾和促內皮細胞黏附的特異性修飾。

2 支架材料結構設計加工及其對血管形成過程的影響

高分子材料的來源、性質和結構設計對血管支架材料至關重要。血管的細胞外基質主要是膠原納米纖維，因此，采用靜電紡絲方法制備血管支架材料能夠模擬血管細胞外基質;采用合適的高分子材料和材料復合與加工技術，可以獲得力學性能與天然血管相似的血管支架。

2.1 材料的選擇與制備

在制備人工血管時選擇高分子材料主要考慮材料的力學性質、生物相容性和可降解性。膠原、殼聚糖、纖維素、明膠、透明質酸等天然高分子生物相容性好，但是力學強度較差。聚已內酯(PCL)，聚乳酸(PLA或PLLA)，聚羥基乙酸(PGA)等合成高分子及其共聚物PLGA，PLCL等，力學性質和降解性可以控制，但是普遍缺少生物活性，需要進行生物功能化修飾。多年來PCL在人工血管及其它支架材料中應用普遍，它具有良好的生物相容性和力學性能。作為血管材料它的不足之處是降解太慢，對血管再生構成障礙。需要選擇更合適的高分子材料，或者采取不同高分子材料的復合，解決支架材料的力學強度、降解速率與組織再生進程的平衡關系。

還有一類可降解高分子材料，近年來特別受關注，它們是通過生物途徑合成的聚合物，其中，最具代表性的是聚羥基脂肪酸酯PHA類材料。其中一個成功的例子是PLA/PHBHHx復合體系。PLA具有較高的力學強度、良好的降解性和加工性。但最大的缺點是脆性較高;而聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸(PHBHHx)是PHA系列聚合物的一個新品種，由于具有較長的側鏈，其結晶度較低，是一種“軟而韌”的聚合物，而且，PHBHHx體外降解速率較慢。研究表明，這兩種聚合物在力學性能和生物降解性等方面具有很大的互補性，在某些比例條件(如80/20或20/80)下形成微相分離結構(如圖1)，材料綜合性能良好［7］。利用該材料構建人工血管的研究正在進行中。

近年來，一些研究組潛心研究新型抗凝血組織工程材料。袁直等將乳酸與蘋果酸共聚形成PLMA，再用多肽GRGDS修飾，形成含RGD多肽的高分子PGS5，研究了其抗凝血性，結果顯示PGS5抗凝血性良好(如圖2)，有潛力用于血管組織工程［8］。

2.2 靜電紡絲制備超細纖維多孔支架材料

人工血管要滿足一定的抗張強度，最重要的是需要具備連通性的孔結構，利于細胞遷移和各種生物活性分子的傳遞。常用的制備方法有鹽析、氣體發(fā)泡和相分離等。但是，靜電紡絲技術更適合人工血管的制備。這是因為電紡絲技術制備的三維纖維結構與天然細胞外基質(ECM)很相似。纖維直徑可以從幾十納米到幾微米，同時具有孔隙率高、比表面積大、孔徑分布較寬的特點。電紡絲制得的無紡布，是由不同取向的纖維堆積而成，纖維之間是疏松的。當細胞黏附到纖維表面時，可以推動周圍的纖維以擴展空間，從而提高材料的細胞滲透性，有利于細胞的侵入生長。

靜電紡絲，簡稱電紡，是用高壓電源將一種極性的電荷引入聚合物溶液或熔體中，然后，聚合物溶液或熔體向帶有異性電荷的收集器加速。隨著溶液(或熔體)與收集器所帶的異性電荷之間的靜電引力以及溶液內部同種電荷之間的靜電排斥作用的增強，溶液最前端的液面將由圓形新月面變成圓錐(稱為Taylor錐)。當電場強度超過液體表面張力時，會從Taylor錐噴射出纖維。纖維穿過周圍環(huán)境，溶劑蒸發(fā)，然后固體聚合物纖維在收集器上沉積，形成無紡纖維氈結構。利用這種方法制成的纖維其直徑一般在幾微米到幾十納米之間(如圖3)［9］。

在制備人工血管時，往往需要對兩種高分子材料進行復合。從同一方向電紡的兩種高分子纖維由于同種電荷排斥作用，在接收器上不能均勻混合。采用圖4a的轉動盤作為接收器，可以得到兩種高分子纖維均勻混合的靜電紡絲膜。采用圖4b接收裝置，可以加工靜電紡絲人工血管(圖4c)。圖4b的每根水平接收桿是轉動的，接收桿直徑可以根據血管的內徑需要進行調換。當使用兩種高分子加工血管時，高分子溶液從接收器兩側電紡，可實現兩種高分子纖維的均勻混合［10－11］。

2.3 通過加工工藝設計，制備有利于細胞向內遷移的大孔支架材料

作者實驗室一直以來，采用靜電紡絲PCL支架作為小口徑人工血管，但是，PCL纖維直徑小，纖維之間孔徑往往小于10 μm，在體外細胞培養(yǎng)和體內埋植實驗中，細胞很難遷移到支架內部，在血管移植實驗中，血管平滑肌再生困難，形成的平滑肌組織層位于支架表面上方，不在支架內部［12］。近來開始嘗試通過水溶性高分子PEO進行致孔，制備結構疏松的PCL靜電紡絲血管。PEO致孔顯著改善了PCL靜電紡絲膜材料的孔徑和疏松程度，改善了細胞向支架材料內部的遷移。

圖1 不同比例的PLA/PHBHHx的顯微紅外照片及相應的譜圖Fig.1 FTIR-microscopic images for PLA/PHBHHx blends with various ratio and corresponding to spectra for labeled dots:(a1～a3)PLA/PHBHHx(40/60)，(b1～b3)PLA/PHBHHx(50/50)，(c1～c3)PLA/PHBHHx(60/40)，(d1～d3)PLA/PHBHHx(80/20)，and(e1～e3)PLA/PHBHHx(20/80))

圖2 高分子上黏附血小板的SEM照片Fig.2 SEM images of adherent platelets on bare polymers:(a)PDLLA，(b)PLMA，(c)P-GS5，and(a’～c’)magnified images of(a～c)

在靜電紡絲的同時，向纖維內部噴入水溶性PEO微球，最后將微球溶解掉，產生需要的孔結構。圖5顯示的是采用PEO致孔的PCL靜電紡絲膜。PEO溶液在電噴條件下形成直徑可調的微球，均勻混合在PCL纖維中間。將PEO微球洗掉以后，形成結構更加疏松的支架材料。

靜電紡絲支架的不足之處是孔徑偏小，不利于細胞的遷移和向內生長。研究人員嘗試各種靜電紡絲技術。如混合電紡，將兩種材料的纖維均勻地混合在一起，兩種高分子具有不同的降解速率，隨著其中一種纖維的快速降解，可以提供更多的細胞生長空間。如PCL和明膠復合材料，通過控制兩種高分子溶液的濃度、流速和接觸距離，來控制兩種纖維的直徑和含量比例。對紡絲膜進行后交聯，可調節(jié)明膠的溶解和降解速率。靜電紡絲前將明膠和PCL分別用FITC和羅丹明B染色，用共聚焦顯微鏡觀察兩種顏色纖維的直徑、分布和混合程度。如圖6所示，兩種纖維能夠均勻混合形成組成均勻的材料。

最近有文獻報道疏松靜電紡絲支架的制備技術。作者在管狀接收器上鉆孔，將接收管與高壓氣體鋼瓶連接(如圖7)，在靜電紡絲過程中調節(jié)氣流壓力，可以產生結構疏松的既有足夠力學性質，又有良好細胞穿透效果的支架材料［13］。

以往的大量研究表明，血管移植后內皮形成在幾周內完成，但是，平滑肌再生卻困難得多。如果植入的人工血管不能形成有功能的平滑肌，血管缺乏收縮和舒張功能，勢必影響血管內皮的功能。血管內皮會發(fā)生老化，血管壁發(fā)生鈣化，血管變硬、變脆，最終導致動脈粥樣硬化、新內膜增生、血栓形成等。

圖5 靜電紡絲支架材料表面的SEM像:(a)傳統(tǒng)靜電紡絲制備的PCL膜材料，SEM顯示其纖維結構致密，孔徑較小，(b)靜電紡絲PCL的同時，電噴PEO微米球所得到的復合支架材料，纖維與球的結合良好，且球的分布均勻，(c)通過梯度酒精脫水，將(b)中的PEO微米球洗去，進行冷凍干燥得到只含有PCL纖維的3D膜材料，與(a)相比其纖維結構疏松，孔徑增大Fig.5 SEM images of surface of scaffolds:(a)PCL membrane produced by traditional electrospinning，SEM showing fibers compact structure and small pore，(b)PCL-PEO composite scaffolds produced by electrospinning PCL and electrospraying PEO microparticles at the same time，SEM images showed uniform distribution of PEO microparticles，PCL fibers excessively combined with PEO microparticles，(c)3D PCL of PEO microparticle removed by gradient alcohol to water and then dehydrated with －20℃ and frozen dryly，SEM images showed scaffolds of loose structure compared with TS PCL scaffolds and pore diameter in 3D PCL scaffolds more bigger than TS PCL scaffolds(a)

圖6 明膠與PCL共紡纖維的共聚焦像:明膠纖維和PCL纖維Fig.6 Confocal images of fluorescence stained fibers blend:gelatin fiber and PCL fiber

圖7 實驗所用的穿孔模芯:(a)標注尺寸的模芯，(b)連接有空氣流的模芯裝置，上方箭頭所指處為氣流進口壓力，下方箭頭所示方向為氣流方向Fig.7 Images depicting perforated mandrel used in our experiment:(a)mandrel labeled with dimensions，(b)mandrel device connected with air line，above arrow showing location of inlet pressure，and down arrow showing direction of air-flow

瑞士Walpoth實驗室對靜電紡絲技術制備的聚已內酯(PCL)小口徑血管，進行了大鼠腹主動脈長期移植研究［14］。他們發(fā)現 PCL具有很好的生物相容性和組織順應性，即使不做任何修飾，PCL血管的內皮形成在2～4周內完成，18個月以后新內膜增生輕微，血管管腔幾乎沒有狹窄。然而，他們發(fā)現在血管植入大鼠體內1.5個月后出現一些軟骨樣細胞。12個月后，軟骨樣細胞繼續(xù)增多，在18個月時大部分支架呈現鈣化。同時發(fā)現，遷移進入血管支架內的細胞密度和微小血管密度在6個月時達到最大，在后期細胞和微血管密度反而下降(如圖8［14］)。這些現象表明，平滑肌再生不完善，血管壁內部沒有實現很好的細胞化，支架孔徑小，纖維降解慢，小血管密度低，血管壁細胞缺乏足夠的營養(yǎng)，是導致后期血管鈣化的主要原因。

人工小口徑血管移植后，血管的再生過程涉及到細胞重塑，細胞的形態(tài)、結構與功能發(fā)生改變，也稱為表型轉化。在正常狀態(tài)下，血管平滑肌細胞主要表現為收縮型，位于血管壁中層，通過細胞收縮使血管壁維持一定張力。但在動脈粥樣硬化、高血壓等疾病出現時，血管平滑肌細胞便會發(fā)生表型轉化，以增殖型為主，在各種刺激因素和生長因子作用下，由中層遷入內膜并大量增殖，導致血管壁增厚。在人工血管移植治療中，平滑肌細胞將首先表現為增殖型，然后轉化為收縮型。

圖8 血管壁隨時間的生物學響應示意圖Fig.8 Schematic representation of biological response in vascular graft wall over time

血管平滑肌再生，可以從人工血管結構設計和活性修飾方面去解決。Guobao Weii等［15］已經將生長因子控釋技術與三維靜電紡絲支架結合起來，制備出能夠穩(wěn)定控釋血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的支架。在下一步實驗中，他們準備將二者結合起來，進一步研究體外培養(yǎng)平滑肌細胞，形成人工血管的技術手段。Jiang Hu［16］等采用復合相分離與電紡技術構建了含大孔的高孔隙率、3D貫通孔結構 PLLA支架(如圖9［16］)，并用于人平滑肌細胞的體外培養(yǎng)，誘導平滑肌細胞進行表型轉變，起到了良好效果(如圖10［16］)。他們將人大動脈平滑肌細胞(HASMCs)種植于該管狀支架(內徑3 mm，外徑5 mm，長4 mm)上，體外培養(yǎng)24 h，然后，將其或空白支架(未種植細胞)分別植入裸鼠皮下，2周后取材，進行相應的組織學檢測。H＆E染色結果表明，實驗組與對照組都有組織的形成，這是由于PLLA血管支架的3D多孔結構為組織的形成提供了可能性(圖10 a)。馬氏染色證實材料周圍及其內部分布大量膠原蛋白(圖10 c)，為形成細胞外基質，加速平滑肌細胞的快速增殖創(chuàng)造了條件。IgG對照的免疫組化染色說明了材料中未發(fā)生抗原抗體反應(圖10 d)，證實了實驗組結果的真實性。利用平滑肌細胞-α-肌動蛋白抗體(SM-α-actin)對鼠源的平滑肌細胞著色，發(fā)現在材料中有一些平滑肌肌動蛋白的分布(圖10 e)。人線粒體抗體對皮下埋植后的材料染色，看到材料內部有線粒體的存在(圖10 f)，說明平滑肌細胞分化作用的發(fā)生。實驗結果充分證明了PLLA血管支架特有的3D多孔結構，可以允許體外種植的HASMCs遷移到支架內部，而且有分化作用的發(fā)生，同時也有宿主自身細胞的遷移。該研究顯示，這種含大孔的高孔隙率、3D貫通孔結構的支架材料，對于細胞向內生長和構建組織工程血管都極為重要。

圖9 含大孔的管狀納米纖維多孔支架:(a)管狀支架全貌，(b)支架橫截面，(c)大孔和貫通孔結構及(d)納米纖維結構的SEM照片Fig.9 Photographs of tubular nano-fibers scaffolds:gross view of tubular scaffold(a)，SEM micrographs of scaffold cross-section(b)，macropores and pore interconnections structure(c)，and nano-fibers structure(d)

圖10 HASMCs細胞在支架上種植培養(yǎng)24 h后體內移植情況:(a)H-E染色，(b)空白支架，(c)移植2周后Masson染色，(d)移植2周之后IgG免疫組化染色(膠原ECM染藍色)，(e)用SMA-actin抗體染色植入宿主SMCs，(f)用人線粒體抗體染色的植入HASMCsFig.10 In vivo implantation of HASMCs-scaffold constructs after 24 h of cell seeding and culture:H-E staining of sections of construction(a)，blank scaffolds(b)，masson's trichrome after 2 weeks of implantation(c)，staining of 2 weeks implants of construction(collagenous ECM stained blue)，immunohistochemical staining of IgG control 2 weeks after implantation(d)，implanted host SMCs stained with SMA-actin antibody(e)，and implanted HASMCs stained with human mitochondria antibody(f)

3 支架材料表面功能化修飾

人工血管表面修飾，主要是抗凝血修飾和促內皮細胞黏附修飾。抗凝血修飾，主要是表面肝素化［17－18］和接枝兩性離子如磷酰膽堿(MPC)［19－21］等。這類研究開展得很多，方法比較成熟，這里不再重點介紹。

3.1 內皮祖細胞(EPC)捕捉

近年來人工血管表面修飾，主要是針對內皮祖細胞(EPC)的特異修飾，實現對外周血EPC的捕捉，使血管材料植入體內后在原位實現快速內皮化［22］。這種手段可以避免組織工程方法中的種子細胞來源、體外培養(yǎng)、內皮層脫落、產品儲存等問題?？捎糜诓蹲紼PC并促進干細胞分化的生物分子包括:血管內皮生長因子VEGF，神經生長因子NGF等;內皮干細胞特異抗體CD34［5］，KDR，CD133等;其它細胞粘附分子 RGD和DNA適配體［5］等。圖11是EPCs在涂覆了EPC特異捕獲分子的人工血管支架的捕獲情況示意圖［22］。圖中表示多肽、蛋白、抗體、磁性分子、適配體都可作為EPCs的捕獲分子，這些分子與EPCs上的靶點鍵合，將內皮祖細胞固定在移植物表面，然后，捕獲的EPCs能夠分化成內皮細胞，并在人工血管上形成內皮層。高分子支架表面具有血液相容性和抗凝血性的涂層，可以阻止其它血細胞或絲素蛋白黏附于表面。

圖11 EPCs在涂覆了EPC特異捕捉分子的人工血管支架上的捕獲情況示意圖Fig.11 Immobilisation of EPCs on artificial vascular grafts coated with EPC-specific capture molecules

Orbus Neich公司將CD34抗體固定到冠狀動脈支架表面，生產出可捕獲內皮干細胞、快速實現內皮化的支架 Genous(TM)Bio-engineered R Stent(TM)［23］，已進入臨床試驗階段。Genous血管支架表面固定CD34抗體，在植入體內1 h后，可觀察到大量的細胞粘附，48 h后，可形成幾乎完整的類似血管內皮的單層。表明CD34表面捕捉細胞的效率很高，這些被捕捉的細胞，加速了血管內皮的進程。臨床研究表明，該支架可募集血液循環(huán)中的內皮祖細胞到支架表面，加速血管損傷部位的內皮自然修復，促使支架更好地與周圍血管組織相容，減少血栓形成的機率，降低再狹窄的發(fā)生。在植入26 d后可形成完全正常的血管內皮。

Rotmans實驗室［24］將CD34抗體固定到以ePTFE為材料的人工血管上，植入豬體內后，3 d可以實現快速內皮化。但是，該研究發(fā)現CD34抗體修飾的血管材料，同樣會發(fā)生內膜增生。

國內許多實驗室在近幾年也開始了類似的研究，如黃楠實驗室開展了用于改善心血管植入金屬支架的研究。他們利用層層自組裝技術，在Ti表面涂布了多層的CD34抗體。這種方法是先在NaOH處理的Ti基質表面沉積一層抗生物素蛋白，再沉積一層生物素化的蛋白A與之前一層相結合，最后，CD34抗體通過其Fc片段與蛋白A結合，露出與抗原結合的Fab段。在這種修飾了的Ti表面培養(yǎng)EPC，并將其植入狗的腹主動脈，結果表明，CD34抗體修飾的表面，能夠增強EPC的粘附和捕捉，在體內能誘導內腔表面的快速內皮化［25］。除此之外，他們還利用一種結合了靜電作用和共價修飾的方法，在氨基硅烷化的Ti表面，形成肝素和纖連蛋白涂層。首先將兩種生物活性分子混合通過靜電作用來形成超分子復合體，之后用基于硅烷的方法，將復合物共價連接在Ti表面。初步的工作結果表明，肝素和纖連蛋白的RGD多肽位點都是有功能的。這種修飾后的材料，具有良好的血液相容性。而且相對于Ti材料，修飾后促進了內皮細胞的粘附增殖等［26］。

3.2 抗菌和抗凝血修飾

計劍實驗室在2003年通過靜電自組裝(ESA)的方法成功地在不銹鋼支架表面加入了PEI和肝素，通過接觸角和電化學阻抗分光學的方法證明了21 d后在Tris-HCl緩沖液中這種涂層仍然是穩(wěn)定的，而通過血小板粘附和靜態(tài)凝血時間實驗表明，這種帶有PEI/肝素涂層的不銹鋼支架，具有一定抑制血小板粘附、延長凝血時間的作用［27］。該實驗室在2005年通過層層自組裝的方法構建了一種能夠抗粘附和抗菌的材料。他們利用殼聚糖抗菌和肝素抗粘附的性質在氨化的PET表面層層自組裝殼聚糖和肝素。大腸桿菌的粘附實驗，說明了在PET表面粘附的大腸桿菌大大高于自組裝后的材料，而且粘附的細菌數量會隨著組裝后pH的降低而減少，表明多層的殼聚糖/肝素能夠有效殺死細菌。這種簡單而有效的方法為抗粘附和抗菌的表面修飾提供了選擇［28］。

3.3 材料表面修飾方法

材料表面的修飾方法有多種，包括共價鍵形式的基團修飾和化學接枝，包括分子之間的生物結合，如抗原與抗體、生物素與結合素、蛋白與蛋白等之間的親和作用，還包括非共價鍵形式的吸附、涂層和自組裝?；瘜W修飾往往是對材料表面進行改性，如改變電荷性質，由電正性表面轉變?yōu)殡娯撔员砻?，或者由疏水表面變?yōu)橛H水表面。在生物材料研究中，往往需要對材料進行活性修飾，即向材料內部或表面引入活性分子，如生長因子、酶或DNA。如果采取化學接枝方法，會導致這些活性分子的失活，而物理吸附方式達不到對活性分子的穩(wěn)定固定。

張旻等采用一種具有兩親性的蛋白HFBI在PCL靜電紡絲支架表面自組裝，將PCL表面的疏水性轉變?yōu)橛H水性，提高了支架的細胞相容性和血液相容性。同時通過蛋白－蛋白之間的相互作用，將CD31抗體吸附固定在HFBI自組裝涂層的PCL支架表面，提高了支架材料表面對內皮細胞的黏附能力(見圖12［29］)。由于HFBI可以結合多種蛋白，這是一個通用性方法，可以用于對其它蛋白分子的固定。這種固定方法是分子之間的相互作用，是生物結合，非化學鍵固定。既具有足夠的穩(wěn)定性，又能很好地保持固定分子的生物活性。

圖12 HFBI固定CD31抗體捕捉內皮細胞Fig.12 Immobilization of anti-CD31 antibody on surface of electrospun PCL scaffolds through HFBI and subsequently specific capture of endothelial cells

對人工血管進行表面功能化修飾時，往往需要固定 多種生物分子，包括肝素、抗體、多肽或生長因子。作者實驗室報告了一種基于環(huán)糊精－金剛烷之間主客體相互作用的表面修飾方法［30］。首先向材料表面固定環(huán)糊精分子，根據需要控制環(huán)糊精在材料表面的接枝密度。同時，對客體分子進行金剛烷修飾。然后，通過金剛烷與環(huán)糊精分子之間的主客體組裝，實現活性分子在材料表面的固定。環(huán)糊精與金剛烷之間的結合不僅特異性強，而且結合牢固。這種修飾方法的優(yōu)點是:①等量反應，由于主客體識別專一性強，材料表面的環(huán)糊精分子數目決定活性分子的固定量。該方法具有“模塊化”的特點，可以根據實際應用選擇不同類型的生物活性分子進行修飾，獲得所需的表面性質。②組成比例可控，有些情況下需要多種活性分子共同修飾，如支架材料表面需要肝素、抗體、生長因子等。由于活性分子的固定只取決于環(huán)糊精和金剛烷之間的分子識別，與活性分子的性質無關，因此，可以根據需要確定兩種或多種活性分子的投料比，即可以準確控制其在材料表面的相對比例，這是其它方法，如共價鍵結合或物理吸附所不能實現的。

實驗方法如圖13所示。在實驗中選用了纖維素基支架材料，首先將環(huán)糊精分子共價偶聯到纖維素纖維表面。同時合成了分子鏈兩端帶有金剛烷基團的聚己內酯(PCL)客體分子。最后，通過環(huán)糊精與金剛烷之間的主－客體相互作用將PCL分子鏈固定在纖維表面，實現了對纖維的表面修飾［30］。

圖13 采用主客體自組裝方法的支架材料表面修飾示意圖Fig.13 Synthesis pathway for cellulose-CD and PCL-AD and the conceptual illustration surface modification for self-assembly process of cellulose-CD with guest polymer PCL-AD

孔德領實驗室合成了一種帶有RGD肽的可自組裝成膠的小分子Nap-FFGRGD。該分子在一定條件下可形成水凝膠，可以在PCL靜電紡絲支架表面自組裝涂層，將PCL纖維表面改性，提高親水性，抑制血小板黏附，并改善細胞的黏附與伸展［31］。接下來，該實驗室利用Nap-FFGRGD涂層修飾的小口徑人工血管開展了兔子頸動脈移植研究。在體外實驗中，修飾材料顯著提高了捕捉內皮細胞、抑制血小板粘附與聚集的能力。通過AV-shunt模型檢測修飾后PCL支架(PCL-RGD)的血液相容性。對體外循環(huán)2 h后的血管支架進行SEM分析，觀察到PCL支架內表面粘附有大量血小板，而PCL-RGD支架表面基本上沒有血小板粘附。

在體內實驗中，植入3 d后，通過SEM觀察材料內表面，在PCL支架上有大量的血小板、紅細胞、炎癥細胞及纖維蛋白構成的血栓基質沉積，但是修飾后的材料內表面是光滑的，基本沒有血小板粘附，證明了其很好的血液相容性。植入4周后(n=5)，利用數字減影血管造影(DSA)測定PCL-RGD支架全部通暢，而PCL由于血栓的形成，支架通暢率只有60%。取材后用SEM觀察支架材料內表面，發(fā)現在PCL支架粘附有一些血栓基質，而在PCL-RGD支架是沒有的，說明該修飾改善了材料的血液相容性(如圖14)。此外，通過HE染色可以看到在PCL-RGD支架上細胞浸潤顯著增加，而且細胞分布更加均勻;通過CD31免疫熒光染色，PCL-RGD支架的內皮化進程大約是PCL支架的3倍;通過α-SMA染色觀察平滑肌再生發(fā)現，4周時支架內表面在內皮層下均不同程度的長有平滑肌細胞層，PCL-RGD的平滑肌細胞平均覆蓋面積有65%，比其在PCL支架上高出23%。說明了RGD的修飾促進了細胞在PCL材料內部的遷移，加速了血管支架的內皮化和平滑肌進程(如圖15［12］)。

圖14 AV-shunt檢測修飾后PCL支架(a)和PCL-RGD支架(b)的血液相容性的SEM照片及血管支架植入兔頸動脈3 d后PCL支架(c)和PCL-RGD(d)支架內表面，血管支架植入4周后的PCL支架(e)和PCL-RGD(f)支架內表面的SEM照片Fig.14 SEM images showing platelet adhesion on the grafts after exposed to blood for 2 h in AV-shunt experiment:(a)PCL grafts and(b)PCL-RGD grafts.The adhesion of platelets and mononuclear cells in PCL and PCL-RGD grafts for 3 d after implantation:(c)PCL and(d)PCL-RGD respectively.SEM images for luminal surface of explanted grafts at 4 weeks after implantation:(e)PCL grafts and(f)PCL-RGD grafts

圖15 通過CD31免疫熒光染色觀察內皮化情況。4周取材后的內皮化比率是通過縱切計算的。＊＊P＜0.01.PCL組(n=3)，PCL-RGD組(n=5)Fig.15 Endothelium characterization by immunofluorescence staining using CD31 antibody.The ratio of endothelialization at 2 and 4 weeks after implantation was calculated based on the staining of longitudinal sections.＊＊P ＜0.01.PCL group(n=3);PCLRGD group(n=5)

4 血管再生微環(huán)境的構建

支架材料的組織再生微環(huán)境非常重要。向支架材料中復合各種細胞外基質，以及與血管再生相關的各種生長因子，可以促進內皮細胞、平滑肌細胞的遷移、黏附、增殖以及分化，為人工血管植入后內皮形成和平滑肌再生提供適宜的微環(huán)境［16－17］。

4.1 生長因子復合于支架材料

杜鳳儀等制備了殼聚糖/聚己內酯(CS/PCL)質量梯度靜電紡絲支架，并負載肝素和VEGF，仿生構建血管壁微環(huán)境［32］。該支架材料抗凝血性增強，能穩(wěn)定持續(xù)釋放VEGF，促進快速誘導內皮化。通過兩種高分子纖維的梯度分布控制，實現肝素與VEGF在血管壁內層高密度固定，達到抗凝血和誘導內皮化形成的作用，同時減弱肝素和VEGF對血管壁內部平滑肌細胞增殖的抑制作用。該研究為小口徑血管組織再生微環(huán)境的構建提出了新思路。

圖16是血管組織工程支架梯度電紡與均勻電紡的示意圖［32］。均勻電紡是在CS(0.5 ml/h)與PCL(1 ml/h)穩(wěn)定流速下進行，梯度電紡在質量梯度流速(CS:0～0.5 ml/h，PCL:0～1 ml/h)下進行，由于肝素和VEGF負載于殼聚糖，因此，梯度電紡更有利于血管內壁抗凝血和快速誘導內皮化。

袁曉燕與孔德領兩個課題組合作，通過同軸共紡，以血小板衍生生長因子(PDGF-bb)與葡聚糖(DEX)為芯層，以PLCL為殼層，研究了血管平滑肌細胞在多孔纖維膜上的粘附、增殖和細胞形態(tài)。結果表明，負載PDGF-bb的多孔纖維膜材料能促進細胞粘附，其細胞活性也顯著提高［33］。

4.2 NO原位控制釋放

內皮細胞通過NO合成酶(NOS)氧化L-精氨酸產生一氧化氮(NO)，對心血管系統(tǒng)的生理與功能發(fā)揮重要調節(jié)作用。從內皮細胞表面持續(xù)釋放的NO能夠有效地防止血小板在正常血管壁上的粘附和活化，能抑制平滑肌細胞的增殖，調節(jié)免疫應答及促進傷口愈合，有助于減少血管再狹窄。由于NO分子對心血管系統(tǒng)的重要性，近年來人們嘗試各種方法制備可釋放NO的生物材料。這些方法包括:①將NO供體作為分散的分子摻入聚合物材料或者共價連接到聚合物骨架上，形成了早期的NO釋放材料，可用于制備成皮下植入或透皮給藥的固體膜或凝膠以及其它醫(yī)學裝置的包衣材料。優(yōu)點是可以通過改變聚合物基質或NO供體結構來調節(jié)NO釋放速率，增加這些包衣材料或醫(yī)學裝置的效率并延長其使用周期［34－35］;② 先制備NO供體衍生物，再將這些衍生物加入不同的聚合物基質中，通過調整聚合物基質比例以及種類控制NO的釋放速率［36－37］;③ 前面兩種方法只有固定的NO儲存量，不能保持持續(xù)、長期的NO釋放。人體內存在著S-亞硝基硫醇類和亞硝酸鹽等內源性的可釋放NO的物質。內源性NO在體內多與蛋白質連接，如S-亞硝基蛋白(AblSNO)，其可以與低分子的硫醇(RSHs)如L-半胱氨酸(Cys)之間發(fā)生快速的亞硝基轉換反應，轉化后得到的CysNO在體內是不穩(wěn)定的，可快速釋放NO。因此，可將諸如L-半胱氨酸或包含L-半胱氨酸的復合物固定在材料表面或者將還原劑以及NO前體混合進聚合物基質中，利用上述的反應來釋放NO，發(fā)揮其生物活性。這種方法的優(yōu)點是利用體內存在的NO供體，保證長期穩(wěn)定的NO供給，NO的釋放也是發(fā)生在材料的植入部位［38］。

圖16 血管組織工程支架梯度電紡與均勻電紡示意圖Fig.16 Schematic diagram of gradient and uniform nano-fibrous scaffolds for vascular tissue engineering

作者實驗室直接將NO供體分子混合到PCL溶液中，制備靜電紡絲支架。發(fā)現NO突釋現象和材料的細胞毒性明顯。采用芯殼結構的靜電紡絲技術，NO供體分子包埋在纖維的內芯，使NO突釋和材料的細胞毒性得到了一定程度的改善［39］。芯殼結構材料上培養(yǎng)的細胞活性明顯高于非芯殼結構的材料，接近于純PCL支架。NO釋放材料表面的血小板粘附顯著低于PCL材料(圖17［39］)，說明NO的釋放有效地抑制了血小板的粘附。

圖17 材料表面粘附血小板的SEM照片:(a)單純PCL紡絲膜，(b)負載NO供體分子的PCL紡絲膜Fig.17 SEM micrographs of adhered platelets on control electro-spun film:(a)pure PCL electro-spun film and(b)PCL electro-spun film with supplier loaded NO moleculars

最近，作者實驗室合成了半乳糖基修飾的NO供體分子，利用半乳糖基團穩(wěn)定NO供體分子，同時實現酶催化控制NO的釋放。該NO供體分子在儲存條件下很穩(wěn)定，不被空氣和水分解，只有在半乳糖苷酶存在的條件下NO才能釋放。將這種新型NO供體分子結合到靜電紡絲血管支架材料中，構成了酶催化NO釋放血管材料。由于人體內含有這種半乳糖苷酶，因此，可以預見這種新的NO釋放材料，可能具有潛在的應用價值。

4.3 轉基因技術應用

基因治療手段常在組織工程中用于提高生長因子和酶的表達，加快組織的形成?；蛑委熗Ｍ虮磉_發(fā)生在病灶部位，而不是全身和系統(tǒng)表達。針對這一特點，文獻報道了多種支架材料介導的基因投遞體系。如將基因載體與DNA的復合物納米粒子固定到材料表面［40］，這類支架材料介導的非病毒基因轉染體系主要是提高了細胞對DNA納米復合物的攝取率，因而顯著提高了轉染效率。張琳華等將抗DNA抗體通過化學鍵結合到血管支架表面，進而固定質粒DNA，并應用治療豬動脈再狹窄，顯示出支架局部基因轉染與表達［41］。

作者實驗室應用了一種不同的方法將DNA固定到電紡絲纖維材料表面。首先將PEG修飾的非病毒載體PEI與PCL溶液混合，制備復合的靜電紡絲支架，再將DNA通過DNA-PEI的相互作用吸附到材料表面。采用PEG修飾的PEI的目的是改善PEI的細胞相容性，并降低PEI在基因轉染中的血清抑制作用。當基因載體分子PEI-PEG從纖維中釋放時，與纖維表面吸附的DNA結合，形成PEI-PEG/DNA納米復合物，粒徑約200 nm。圖18是PEI-PEG/DNA在溶液中和在纖維支架上顆粒尺寸的分布，圖19是其在溶液中和在纖維支架上形成的顆粒的 TEM 照片［42］。

5 結語

人工血管需要同時解決抗凝血、促內皮細胞生長和平滑肌再生的問題。血管內皮和平滑肌都有復雜的生物學特性，人工血管的研究涉及多學科的交叉。在材料方面，應重點開展新材料、結構設計、功能修飾、降解問題、新制備工藝等內容。同時，應從分子和細胞水平研究材料與心血管系統(tǒng)的生物應答，探討材料學因素對心血管組織修復的影響。

人工血管的研究不單是材料制備的問題，生理和病理等各種生物學因素直接影響材料的植入效果和轉歸。因此，需要在心血管生物學方面深入研究巨噬細胞、內皮細胞與動脈粥樣硬化等信號傳導及其他生物學機制。在心血管生理病理方面深入研究內皮細胞、平滑肌細胞的生理與功能，研究二者在疾病狀態(tài)下的損傷、修復與再生過程的信號傳導與干預機制。

此外，深入系統(tǒng)地開展心血管生物材料基礎研究，需要多學科交叉和研究團隊建設，這是解決人工血管研究的復雜問題和加速該研究方向產業(yè)化進程的關鍵。

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The Development of Construction of Small-Diameter Vascular Grafts in Vivo

WANG Shufang，ZHENG Wenting，KONG Deling
(State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology，College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Although there is a growing demand of small-diameter vascular grafts for cardiovascular disease，the incidence rate of restenosis caused by vascular grafts remains high.An effective approach to improve the function of small-diameter vascular grafts and realize the blood vessel regeneration would be to induce a healing response in vivo for tissue engineering.In this article，we summarize the recent research developments on small-diameter vascular grafts，and highlight the main designing ideas and research outcomes in our laboratory.The work includes structural design and fabrication of porous scaffolds，anti-clotting modification，functionalization for endothelial progenitor cells(EPCs)capture，creation of micro-environment for vascular smooth muscle regeneration and angiogenesis.Some directions and problems on future research in these areas are also discussed.

vascular grafts;tissue engineering;scaffold preparation;stem cell capture;endothelialization;smooth muscle regeneration;extracellular microenvironments

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0006－14

2012－04－23

國家973研究計劃項目(2011CB964903，2012CB725203);國家自然科學基金資助項目(50830104，51073081，81000680)

王淑芳，女，1963年生，教授，博士生導師

孔德領，男，1966年生，教授，博士生導師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.02