三角帆蚌人工感染細菌性疾病的組織病理學觀察

王 偉，蔣 幀，錢國英，陳吉剛

(浙江省重中之重學科實驗室 浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100)

三角帆蚌 (Hyriopsis cuminglii)又稱河蚌、三角蚌、珍珠蚌，隸屬于瓣鰓綱 (Lamellibrachia)、真 瓣 鰓 目 (Eulamellibranchia)、 珠 蚌 科(Uionidae)、帆蚌屬 (Hyriopsis)，是廣泛分布于我國淡水湖泊等水域的大型雙殼類底棲動物，也是我國特有的優質淡水珍珠蚌。因該蚌貝殼外形略呈不等邊三角形，背緣向上伸展成三角帆狀，故名三角帆蚌［1］。多年來，三角帆蚌的蚌病一直是制約淡水珍珠養殖發展的瓶頸問題之一，嚴重時大范圍內頻繁發生。近年來，我國南方各省三角帆蚌養殖發展勢頭迅猛，三角帆蚌病害也呈現逐年增多的趨勢，造成三角帆蚌大批死亡，給三角帆蚌養殖戶帶來了巨大的經濟損失。

自1982年國內首次報道了三角帆蚌疾病病例并分離到點狀產氣單胞菌后［2］，科學家們才陸續開展了三角帆蚌死亡原因分析、疾病防治及流行規律等方面的研究。但關于三角帆蚌組織病理的相關研究和報道尚比較缺乏。劉巧林等［3］運用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察了三角帆蚌感染瘟病后外套膜、鰓和斧足的病理變化特征。最近，鐘蕾等［4］報道了人工感染三角帆蚌病毒性疾病的組織病理學結果，發現消化腺、胃、腸、外套膜、斧足和鰓等均出現大量細胞空泡化、腫大，為病毒損害的主要靶器官。本課題組在前期三角帆蚌流行病學調查中采集到典型癥狀的病蚌，分離鑒定出其細菌性病原，并以此用人工方法感染健康三角帆蚌，探討該細菌病對三角帆蚌主要組織器官的影響，旨在為三角帆蚌的病害防治研究提供理論基礎，現將相關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

育珠三角帆蚌10只取自紹興大阪南大江養殖場，3齡，平均體長16.9 cm，飼養在浙江萬里學院水生生物健康養殖試驗室水族箱中，恒溫 (25±0.5)℃，飼養1周確認無病菌后進行人工感染試驗。三角帆蚌活病體同樣采集于紹興大阪南大江養殖場，為1～3齡。

1.2 人工感染

從具有明顯癥狀的蚌的病灶組織分離到4株優勢細菌，進行培養接種。試驗組注射細菌濃度為8.6×108mL-1，對照組注射的是0.01 mol·L-1的PBS緩沖液。注射總劑量為1 mL，從斧足多次點狀注射，注射深度為 0.5～1.0 cm。注射后置(25±0.5)℃水中飼養。

每天觀察并記錄試驗蚌的發病情況和死亡情況，以吐水無力、分泌大量粘液和閉殼肌收縮無力作為病蚌的判斷標準。

1.3 病蚌組織的采集

對發病蚌仔細觀察，確認具有典型病癥后取樣。分別采集病蚌和健康蚌的內臟團、腸道、閉殼肌、外套膜、鰓、斧足和直腸組織，以健康蚌的相應部位組織作為對照樣品。采集的樣品迅速投入4%甲醛溶液固定24 h。

1.4 石蠟切片制作

以常規石蠟切片程序進行脫水、透蠟、包埋，切片厚度8μm，經常規HE染色后在顯微成像系統下進行觀察和拍照。

2 結果和分析

2.1 臨床癥狀

三角帆蚌病蚌體內有大量粘液排出，雙殼微微張開，斧足緊縮不伸展。解剖顯示，健康蚌的鰓顏色為暗黃色，而病蚌鰓組織呈褐色;健康蚌斧足和外套膜為乳白色，而病蚌的顏色為黃色;病蚌腸道有不同程度的腫大和腹水。健康和患病珍珠蚌臨床癥狀觀察結果見圖1。

圖1 健康和患病三角帆蚌的臨床癥狀比較

2.2 組織病理變化

閉殼肌。與健康蚌的閉殼肌組織相比，患病個體的閉殼肌纖維略顯膨大，細胞之間的距離較大，且肌纖維彎曲程度小 (圖2)。這些結果的原因可能是由于一些死亡的細胞由于骨架結構的變化而造成的。

圖2 健康和患病三角帆蚌的閉殼肌組織學比較

腸道。健康蚌的腸道中含有大量空泡結構，這些結構連結成片;而在患病個體腸道組織中空泡結構小而稀疏 (圖3)。

此外，與健康蚌相比，患病個體腸道外圍柱狀上皮較健康個體細胞核細長，這可能代表了細胞不同的分化狀態。

圖3 健康和患病三角帆蚌的腸道組織學比較

外套膜。健康個體的外套膜細胞聯系緊密，組織中間是疏松連接的組織，中間有多個空泡;而患病個體的外套膜內部細胞已喪失細胞形態，幾乎與外周上皮細胞沒有聯系 (圖4)。

圖4 健康和患病三角帆蚌的外套膜組織學比較

肝臟。圖5結果可以看出，健康個體的肝臟細胞排列整齊，管狀組織外圍細胞排列整齊;而患者肝臟管狀組織外圍細胞排列不整齊，細胞核深染，細胞連接松散。

鰓。健康個體的鰓組織細胞排列致密，細胞核形態為長梭形;而患病個體的鰓組織細胞排列疏松，細胞核形態為長圓形 (圖6)。

直腸和斧足。健康蚌直腸上皮由單層柱狀纖毛上皮細胞和少量杯狀細胞組成，與患病個體的直腸組織學沒有明顯差異 (圖7)。

從圖8可以看出，斧足組織學也沒有發現明顯差異。

圖5 健康和患病三角帆蚌的肝臟組織學比較

圖6 健康和患病三角帆蚌的鰓組織學比較

圖7 健康和患病三角帆蚌的直腸組織學比較

圖8 健康和患病三角帆蚌的斧足組織學比較

3 小結與討論

人們一致認為蚌病防治難，主要是蚌病臨床診斷難，而病癥觀察、病蚌解剖及多種病理變化的比較是確診蚌病的重要線索［5］。本試驗對三角帆蚌人工感染細菌性疾病的病理變化進行了全面觀察。臨床病理變化主要表現為病蚌腸黏膜上皮細胞有不同程度的變性和壞死;內臟團細胞排列不整齊，細胞核深染;鰓組織糜爛，細胞排列疏松，明顯的組織病理學改變可以為蚌病的有效診斷提供借鑒。

試驗結果發現，內臟團 (肝臟)、腸道和鰓組織是三角帆蚌發病時的主要典型病變器官。這與已報道的三角帆蚌爆發細菌性疾病時的典型癥狀相符合［5-7］。文祝友等［6］曾報道，嗜水氣單胞菌對三角帆蚌的肝臟破壞最嚴重，其次是鰓，使得鰓絲細胞排列松散，纖毛受到不同程度的破壞，再次是腸和斧足。向建國等［7］研究了三角帆蚌人工感染氣單胞菌后病理組織的顯微結構，也發現肝臟、腸道和鰓組織發生了明顯的病理變化，其中鰓組織首先遭到破壞，呈現炎性水腫，肝組織發生嚴重變性、壞死。當三角帆蚌發病時，最明顯的病理變化往往集中在肝臟上，說明肝臟是細菌或病毒侵染的靶器官。與三角帆蚌瘟病不同的是，有學者報道，瘟病引起的組織病理變化主要部位除了肝臟，還集中在病蚌的胃和直腸上［8］，這可能與三角帆蚌的發病類型及發病機理有關。我們認為，細菌性疾病首先破壞的是三角帆蚌的消化系統和消化功能，進而破壞呼吸系統直至窒息死亡。試驗結果可以為生產上開展三角帆蚌細菌性疾病的防治提供重要依據。

［1］ 劉凌云，鄭光美.普通動物學 ［M］.3版.北京:高等教育出版社，1997:220-221.

［2］ 倪達書，葛蕊芳，葉振榮.三角帆蚌疾病的初步研究 ［J］.淡水漁業，1982(5):41-42.

［3］ 劉巧林，許寶紅，鐘蕾，等.三角帆蚌瘟病組織病理學動態變化［J］.湖南農業大學學報:自然科學版，2009，35(4):406-411.

［4］ 鐘蕾，肖調義，黃倢，等.人工感染三角帆蚌病毒性疾病的組織病理學觀察 ［J］.水生生物學報，2011，35(4):666-671.

［5］ 張根芳，方愛萍.淡水育珠蚌疾病臨床診斷若干重要問題的探討 ［J］.淡水漁業，1999，29(5):10-13.

［6］ 文祝友，劉曉燕，金燮理，等.三角帆蚌嗜水氣單胞菌病的病理研究 ［J］.湖南農業大學學報:自然科學版，2001，27(1):56-59.

［7］ 向建國，鐘蕾，黃興國.三角帆蚌細菌病病理組織的顯微結構研究 ［J］.內陸水產，2009(1):50-53.

［8］ 邵健忠，項黎新，李亞南，等.三角帆蚌瘟病的組織病理研究 ［J］.水產學報，1995，19(1):1-7.