大鼠血管生成素-2在膿毒癥型急性肺損傷中的變化

錢知勉，張麗丹 ，馮國營，殷彥君，余獻丹

(1.樂清市第三人民醫院 呼吸與心血管科，浙江 樂清 325604；2. 濱州醫學院 基礎學院，山東 濱州 256603)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是指心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭，PaO2/FiO2比值≤300,但>200，其余指標與急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)相同[1]。膿毒癥引起的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)、膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征(MODS)是其重要致死原因[2]。促血管生成素(Ang)是一類由血管內皮周圍細胞分泌的糖蛋白，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4[3]。其中，Ang-2由血管內皮細胞合成并儲存于內皮細胞，內皮細胞受刺激后Ang-2可被快速釋放，Ang-2與Tie-2(一類具有較高同源性的受體酪氨酸激酶)結合，發揮生物學效應，過表達可破壞血管形成，導致血管通透性增高，在急性血管反應如ALI中有重要作用。本研究通過盲腸結扎穿孔術誘導膿毒癥制作SD大鼠ALI模型，對SD大鼠ALI中肺組織變化和血清Ang-2水平進行研究，并探討其相互關系及影響，為防治ALI提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

成年雄性SD大鼠45只,體重200～250 g(濱州醫學院實驗動物中心提供)，隨機分為兩組，對照組10只，實驗組35只。大鼠血管生成素2(Ang-2)ELISA試劑盒，購自美國ADL公司。

1.2 模型制備

實驗組ALI模型制備：術前大鼠禁食12 h，禁水8 h，3%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒腹部，沿腹白線中段作一長1.5 cm的切口,剪開皮膚和肌層，探查腹腔分離盲腸，在距盲腸末端1 cm處用3-0絲線結扎盲腸，注意避免結扎盲腸動脈及引起腸梗阻，用16 G穿刺針在盲腸游離面(腸系膜對面)上貫穿3次，針孔間距約3 mm，并擠出少許內容物，還納腸管。術畢逐層關腹，并于腹壁皮下注射林格液3 mL /100 g抗休克處理。術后自由進食飲水。對照組假手術處理，僅做無菌開腹與盲腸翻動。實驗組存活23只，死亡12只，存活率65.7%。

1.3 標本處理

分別于假手術及盲腸結扎穿孔術后24 h處死全部大鼠，剪取肺組織，常規石蠟包埋，HE染色觀察肺部病理變化，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清Ang-2水平，具體步驟按試劑盒說明操作。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 肺組織變化

對照組SD大鼠肺臟光鏡下肺組織結構清楚，肺泡腔清晰,肺泡隔基本無水腫、炎癥等特殊改變；實驗組光鏡下見部分肺泡萎陷，肺泡壁通透性增加，可見較多中性粒細胞及少許巨噬細胞浸潤，肺泡間隔增寬等(圖1、2)。

圖1 對照組肺組織(HE ×200)Fig 1 The lung tissues of control group(HE ×200)

圖2 實驗組肺組織(HE ×200)

2.2 Ang-2水平檢測結果

實驗組SD大鼠Ang-2水平(10.72±1.49)ng/mL明顯高于對照組(3.87±0.26)ng/mL,P<0.01；實驗組內死亡組SD大鼠Ang-2水平(11.48±1.52)ng/mL亦顯著高于存活組(7.69±1.83)ng/mL,P<0.05。

3 討 論

急性肺損傷(ALI)是一個炎癥和通透性增加的綜合征，以肺泡-毛細血管膜屏障的破壞為特征，造成富含蛋白的肺泡水腫液的形成和持續的低氧血癥[4]。動物模型的建立及應用在了解掌握其發病機制、病理生理改變中占有重要的地位，本實驗模型(即盲腸結扎/膿毒癥型)是經腹手術在動物盲腸上刺孔并結扎使動物發生組織壞死和腸源性腹腔感染導致全身炎癥反應綜合征，進一步發展成ALI。發病機制除了內毒素造成以外，還存在腸道其它細菌毒素的致傷作用、手術打擊等，故此種模型病情重，肺部病理損害也明顯，是較理想的ALI模型之一[5]。

人類Ang-2基因定位于第8號染色體短臂上(8p21),由496個氨基酸組成, 人鼠同源性為85%，Ang-2能夠和血管內皮細胞上的Tie-2受體相結合激活相應信號通路發揮作用，導致血管通透性增高，增加血管滲漏，表明Ang/Tie-2系統在炎癥反應內皮細胞活化中起重要作用[6]；同時Ang-2是嚴重創傷后內皮激活和功能障礙的標志物[7]；John S Giuliano等[8]推測外周血Ang-2的水平是一個早期內皮細胞活化及損傷的理想指標；Gallagher等[9]發現，在外科ICU伴ALI/ARDS患者中，死亡組血中Ang-2水平比存活組明顯增高，同時還發現，體外用高Ang-2的血漿對內皮細胞單層刺激可破壞其內皮連接，血管內皮鈣黏蛋白在內皮連接處分布紊亂，有肌動蛋白應力纖維形成，引起內皮細胞間隙形成；與此相似，Parikh等[10]的研究首次發現Ang-2是膿毒癥相關肺損傷時內皮屏障破壞的重要介質，在氧合受損的膿毒癥患者，血循環Ang-2水平明顯增高，體外應用患者血清可破壞內皮細胞屏障，且內皮屏障的破壞程度和Ang-2含量相關，由此引起肺水腫。本實驗觀察到實驗組SD大鼠血清Ang-2水平明顯高于對照組，死亡組水平高于存活組，說明血清Ang-2的升高與ALI嚴重程度相關，導致肺內皮屏障功能和結構的不同程度的破壞，血管失穩，引起血管滲漏，表現為中性粒細胞及巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬等，另外血清Ang-2水平的變化對ALI病情評價和預后具有參考價值。由此可見，Ang-2確定是ALI引起肺血管滲漏的關鍵因素之一，可能利用了脂多糖及腫瘤壞死因子-a等明顯上調了肺微循環內皮細胞Ang-2的表達，使血管退化，這與Parikh等發現Ang-2可誘發急性肺水腫的研究結果有類似性。

綜上所述，本研究盲腸結扎穿孔術制造SD大鼠膿毒癥ALI模型中，肺組織中性粒細胞及巨噬細胞表達增多，血清Ang-2水平也顯著升高，表明Ang-2在膿毒癥型ALI中具有重要病理作用，血清高Ang-2水平提示預后較差，但具體機制有待進一步探討。

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