甲醇中毒大鼠視網膜及肝臟細胞的超微結構改變

呂海辰，齊曾鑫，傅曉鍵，蔡加彬，沈奇偉，樸豐源

(1.復旦大學上海醫學院 8年制臨床醫學，上海 200032；2.大連醫科大學 勞動衛生與環境學教研室，遼寧，大連，116044)

甲醇(Methanol, CH3OH)，是結構最簡單的飽和一元醇，又稱“木醇”或“木精”，是一種無色、有毒的揮發性酒精氣味液體，可經呼吸道、胃腸道和皮膚吸收入血，進而導致中毒，是假酒的主要致毒物質。近年因飲入假酒致甲醇中毒的病例常發生，患者急性期主要表現為肝臟損傷，愈后常遺留不同程度的視力障礙[1-3]。有關甲醇中毒的研究并不少見，但多僅限于臨床病例報道[4-5]，而對甲醇引起的肝細胞和視網膜細胞形態學，特別是超微結構變化的中毒病理學研究報道尚少。本研究選用SD大鼠，用甲醇和乙醇的不同比例混合液模擬假酒灌胃，建立假酒中毒動物模型，觀察甲醇中毒引起的肝細胞和視網膜細胞的超微結構變化，探討甲醇所致肝臟功能障礙和視力損害的超微結構形態學基礎，為有效治療甲醇中毒提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

健康雄性SD大鼠16只，用隨機數排序法分為4組,每組4只。即甲醇組，被給于25%甲醇蒸餾水；甲醇、乙醇混合組，被給于25%甲醇生理鹽水與25%乙醇蒸餾水等量混合液；乙醇組，被給于25%乙醇蒸餾水；對照組，被給于蒸餾水。將首次灌胃的時間被定為0 h，分別在灌胃后的第10 h、24 h、48 h對各組大鼠再進行灌胃。甲醇組：首次甲醇灌胃劑量為2 g/kg，其后每次1 g/kg；甲醇、乙醇混合組：以甲醇計量，首次劑量1 g/kg，其后每次0.5 g/kg；乙醇組：乙醇灌胃劑量為2 g/kg，其后每次1 g/kg；對照組：與實驗組等劑量蒸餾水灌胃，首次氯化鈉劑量為8 g/kg，其后每次4 g/kg。在進行實驗前先行預實驗來熟練技術方法和確定試藥劑量，以盡可能減小實驗技術造成的組間誤差。

1.2 評價指標及實驗方法

1.2.1 動物模型建立：以大鼠對光刺激的反應速度作為評價模型是否成功建立的依據。正常大鼠對迎面光照刺激反應敏感且迅速，而染毒大鼠對同樣光刺激的反應遲鈍甚至消失。

1.2.2 全身及眼、肝臟中毒表現：通過觀察和記錄藥物灌胃后大鼠的反應速度、活動、意識狀態及對光刺激的反應變化確定大鼠是否中毒。

1.2.3 染毒大鼠肝細胞和視網膜細胞的超微結構觀察：灌胃48 h 脫臼法處死大鼠，迅速摘除肝臟及雙側眼球，分離切取1 mm×5 mm大小肝和視網膜組織，PBS沖洗后2.5%戊二醛固定，4 ℃冰箱過夜。次日，1%四氧化鋨后固定2 h，丙酮系列脫水，定向包埋，半薄切片顯微鏡下定位，并制成超薄切片。以醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，透射電鏡下觀察肝細胞和視網膜細胞的超微結構變化。

2 結 果

2.1 中毒表現

對照組動物毛色光亮，反應如常，眼、鼻處肉眼觀均無異常。與對照組相比，甲醇組動物毛色灰暗，活動減少，反應呆滯，對光刺激的反應明顯減弱，結膜出血、鼻孔出血，并伴有運動失調；甲醇、乙醇混合組動物毛逆、成團、欠規則，反應遲鈍，對光刺激無強烈反應，結膜充血，鼻孔出血，運動不靈活。上述兩實驗組大鼠的異常變化在第1次灌胃后開始出現，且隨灌胃次數增加不斷加重，且相鄰兩次灌胃之間癥狀不緩解。乙醇組動物毛色一般，反應遲鈍，對光刺激反應較弱，眼部結膜無明顯充血或出血，鼻孔無出血，每次灌胃后上述反應加重，但在相鄰兩次灌胃之間癥狀緩解。實驗結束時，甲醇組及甲醇、乙醇混合組動物的體質明顯減弱，而乙醇組動物則略虛弱于對照組。

2.2 電鏡下病理變化

2.2.1 肝組織的改變：對照組動物肝細胞線粒體排列有序，大小一致，多數呈球形，電子密度較大，可見嵴結構；粗面內質網排列整齊、核糖體顆粒豐富(圖1a)。與對照組相比，乙醇組動物肝細胞線粒體體積大小不等，形態略不規則，電子密度明顯降低，部分基質溶解、部分嵴結構消失；內質網數量減少，并擴張、膨脹、膜融合，核糖體脫落并與病態內質網混合于胞質中(圖1b)。甲醇組動物肝細胞線粒體的形狀不規則和大小不等，電子密度降低，雙層膜和嵴結構均模糊不清；粗面內質網數量減少、并有脫顆粒現象，高度囊性變與少量核糖體顆粒混溶形成胞質的溶解區(圖1c)；甲醇、乙醇混合組動物線粒體極度腫脹、幾呈空泡狀，大小、形狀沒有規則，雙層膜結構幾乎消失，電子密度很低，絕大多數粗面內質網消失與極少量核糖體混合為形狀及分布均不規則的大片溶解區(圖1d)。

2.2.2 視網膜組織(視錐視桿層細胞外節膜盤)的改變：對照組大鼠視網膜外核層感光細胞外節內膜盤(即光感受器)呈規則、有序板層排列，膜盤界限分明(圖2a)；乙醇組動物視網膜膜盤結構仍清晰、規則，部分區域排列略疏松，磨盤之間分界明顯(圖2b)；甲醇組動物視網膜膜盤感光細胞排列不規則，膜盤間縫隙增大,并失去正常板層結構，同時可見空泡樣改變，局部出現膜盤溶解、相互融合、分辨不清(圖2c)；甲醇、乙醇混合組動物視網膜外節膜盤排列無規則，膜盤縫隙明顯增大，有明顯的空泡樣改變，局部區域膜盤徹底失去板層樣結構而呈紊亂排列的髓樣結構，磨盤失去界限，相互融合(圖2d)。

圖1 各組大鼠肝細胞胞質局部超微結構 ×6500Fig 1 Cytoplasm ultrastructure of liver cells in each group ×6500

圖2 各組大鼠視網膜視錐視桿層膜盤超微結構 ×6500Fig 2 Ultrastructure of retinal cone-rod layer membrane discs in each group ×6500

3 討 論

人類急、慢性甲醇中毒的主要臨床表現為肝臟功能的衰竭、眼部的損害和神經系統的損傷。臨床上，以甲醇攝入史、血液甲醇濃度異常、肝臟、眼部和神經系統損害的癥狀為診斷依據；體征如頭痛、意識功能障礙、感覺障礙、視物不清、視野縮小、視網膜電圖和視覺誘發電位異常等[4-5]。本實驗主要采用灌胃的方式模擬甲醇經口進入的過程，建立了大鼠甲醇中毒動物模型，并借鑒臨床對患者觀察和診斷的一些方法，觀察了染毒動物的體表和行為變化。發現動物模型中大鼠染毒后的出現的體表改變和行為變化與甲醇中毒患者相似，提示大鼠已發生了甲醇中毒。

電鏡下，甲醇染毒或甲、乙醇混合染毒大鼠肝細胞的線粒體腫脹，雙層膜的原有結構發生模糊，同時有粗面內質網的退化、擴張、溶解、脫顆粒等。肝臟是人體物質代謝的重要器官，其解毒、合成作用強大，且不可或缺[6]。肝臟功能的完成依賴于完整的細胞內膜系統的存在，內質網在其中起到了重要作用。因而甲醇對內質網的破壞作用必然影響肝臟的解毒過程以及各種物質的合成；線粒體的損害則影響到了肝組織的能量供應，必然會使肝組織的代謝水平顯著下降。值得注意的是，同時染毒甲醇和乙醇動物的肝細胞的上述損害更為顯著。假酒多由甲醇與乙醇勾兌而成，其對人體肝臟的傷害可能重于單一甲醇。

甲醇對眼部損害主要體現在眼底的異常改變和結膜充血或出血。本實驗發現甲醇對感光細胞的光感受器(膜盤)有明顯的損傷作用。這種損傷使光刺激傳遞通路從初始點就出現了功能障礙，嚴重影響視網膜視覺信號傳導產生[7]，這可能是甲醇中毒引起視覺障礙的原因之一。

視網膜各層，尤其是光感受器內的生化代謝極為活躍，是體內耗氧量較高的器官之一，而線粒體則是細胞內提供能量的主要裝置。若線粒體電子傳遞及氧化磷酸化受阻，將導致細胞離子泵功能障礙，各層組織以及細胞器的水腫和病態膨脹，從而影響細胞功能。甲醇對視力的損傷可能與其對線粒體的損傷作用有關。

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