CDK2、CDK4基因與自體移植靜脈內(nèi)膜增殖的關系

亓 明，王新文，羅英偉，秦嶺峰，馬文鋒，張 強，辛世杰，段志泉

(1. 大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 血管外科, 遼寧 大連 116011；2.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 血管外科，遼寧 沈陽 110011)

自體靜脈旁路移植術是臨床上治療動脈阻塞性疾病的重要手段，常用于冠心病和動脈硬化閉塞癥的血管重建。但由于內(nèi)膜增生(Intimal hyperplasia，IH)及后期的動脈硬化所導致的移植段血管中遠期狹窄和閉塞，影響了療效。現(xiàn)有資料證明，IH的發(fā)生為多種因素綜合作用的結果，其中血管平滑肌細胞(SMC)向內(nèi)膜遷移并過度增殖是其病變演變的重要環(huán)節(jié)[1]。而SMC的增殖，則有賴于細胞周期的進入和進行[2]。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程, 細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin dependent kinase, CDK) 表達及活性的調控是細胞周期調控的核心,其中CDK2 和CDK4 主要作用于G1期和S期,具有啟動DNA復制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用[3]。體外實驗已顯示CDK2 、CDK4與細胞增殖之間有密切關系,其表達增加導致DNA 合成增加、進而促進細胞分裂增殖,而其水平下降或其抗體治療能夠抑制或減少細胞增殖[4]。

本實驗應用RT-PCR方法和免疫組織化學方法研究細胞周期中G1/S期最具有代表性的CDK2、CDK4在移植血管不同時期的表達情況，探討其對自體移植靜脈SMC增殖和IH的作用,為自體移植靜脈再狹窄的防治提供一些依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

CDK2、CDK4多克隆抗體，即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；CDK2、CDK4、內(nèi)參照β-actin引物由上海生物工程公司合成。

1.2 實驗對象及分組

雄性Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供)50只，2.5～3.0個月齡，體重250～300 g，參照隨機對照表隨機分為：1，2，3，7，14 d組，每組10只,各實驗組大鼠正常頸靜脈為對照組。

1.3 動物模型的建立及標本制備

Wistar大鼠用10%水合氯醛(3 mL/100 g)經(jīng)腹腔麻醉后，在手術顯微鏡下切取0.5 cm長頸內(nèi)靜脈間置移植于同側頸總動脈，完成后移植段血管充盈，搏動有力，示血管移植成功。

實驗動物分別于術后1、2、3、7及14 d麻醉狀態(tài)下處死取材。液氮快速冷凍后轉-70 ℃保存。

1.4 觀測指標

(1)組織學觀察：切片行HE染色和Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色，用計算機圖像分析儀觀察血管中段橫截面內(nèi)膜，每60度測量1次該處內(nèi)膜厚度，共6處，計算平均厚度。

(2)CDK2、CDK4免疫組化觀察：切片予微波抗原修復后，SABC法,DAB顯色，CDK2、CDK4定位于細胞核和細胞漿，陽性細胞胞核與細胞漿染呈棕黃或黃色，每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，計數(shù)單位視野陽性細胞占總細胞數(shù)的百分率，陽性細胞數(shù)<10%為陰性，記為(-)；10%≦陽性細胞數(shù)<50%為陽性，記為(+)；陽性細胞數(shù)>50%為強陽性，記為(++)。輔以計算機圖像分析儀結果。所有結果均由2人盲法單獨判定。

(3)應用RT-PCR觀察CDK2,CDK4 mRNA表達：組織勻漿，苯酚/異硫氰酸胍法提取總RNA，進行反轉錄合成cDNA，CDK2 上游引物5′-AAGATCGGAGAGGGCACGTACGGAGTGGTG-3′，下游引物5′-AGGCTCTTGCTAGTCCAAAGTCTGCCAACT-3′，擴增片段長度為430 bp；CDK4上游引物5′-GCTACCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAA-3′，下游引物5′-GGTGCTTTGTCCAGGTATGTCCGTAGGTCC-3′，擴增片段長度為320 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5′-GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3′，下游引物5′-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3′，擴增片段長度為690 bp。以β-actin為內(nèi)對照進行PCR擴增(RT-PCR)，擴增產(chǎn)物進行電泳于凝膠自動成像儀1D Kodak上自動成像，應用GelWorks 1D Advanced軟件進行結果定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 移植靜脈內(nèi)膜平均厚度的變化

各組不同時期移植靜脈內(nèi)膜平均厚度情況見表1。移植后7 d，內(nèi)膜厚度與管壁厚度接近高峰，與對照組及移植后1、2、3 d比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 移植靜脈CDK2、CDK4陽性細胞表達率的變化

在正常細胞中僅有少量CDK2、CDK4陽性表達，不超過5%，陽性表達在光鏡下表現(xiàn)為棕黃色。移植后1 d陽性細胞表達開始增多。移植后2 d，陽性細胞表達明顯增加，至7 d時達到高峰。與移植后1 d相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。移植14 d后，陽性表達回落，但仍高于正常水平(P<0.05)。

組別1d2d3d7d14d移植靜脈組5.01±0.55.50±1.36.90±1.513.61±1.21)14.20±1.81)對照組4.54±0.44.63±0.94.52±0.84.78±0.54.69±0.7

1)與移植后1、2、3 d及對照組比較，P<0.05

各組不同時期移植靜脈內(nèi)膜、中膜CDK2、CDK4陽性細胞表達率見表2。

表2不同時期移植靜脈內(nèi)膜、中膜CDK2、CDK4陽性細胞表達率

Tab 2 Expression of positive cell in grafted vein (±s, %)

1)與移植后1 d及對照組比較，P<0.05

2.3 移植靜脈中CDK2、CDK4基因表達的變化

2.3.1 CDK2、CDK4基因電泳結果:CDK2基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結果見圖1。同一泳道中CDK2基因的表達產(chǎn)量自術后第2天普遍高于內(nèi)對照β-actin表達產(chǎn)量，靜脈移植術后7～14 d為CDK2基因表達的高峰。CDK4基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結果見圖2。同一泳道中CDK4基因的表達自術后第2天產(chǎn)量普遍高于內(nèi)對照β-actin表達產(chǎn)量，靜脈移植術后7～14 d為CDK4基因表達的高峰。

圖1 CDK2基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

Fig 1 CDK2 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker為DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp構成。擴增片段長度430 bp。Ladder 1-5分別為靜脈移植術后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d擴增結果，Ladder 6為正常對照靜脈，擴增結果為陰性。

圖2 CDK4基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

Fig 2 CDK4 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker為DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp構成。擴增片段長度320 bp。Ladder 1-5分別為靜脈移植術后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d擴增結果，Ladder 6為正常對照靜脈，擴增結果為陰性。

2.3.2 CDK2、CDK4基因表達半定量分析結果：CDK2、CDK4基因表達半定量分析結果見表3、4。CDK2、CDK4的基因表達產(chǎn)量在靜脈移植后1 d就開始增加，7～14 d達到高峰。與3 d內(nèi)表達比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。

表3 CDK2基因表達半定量分析結果

1)與移植后1、2、3 d比較，P<0.05

表4 CDK4基因表達半定量分析結果Tab 4 Semi-quantitative result analysis of CDK4 gene expression

1) 與移植后1、2、3 d比較，P<0.05

3 討 論

移植靜脈IH是一個多因素、多途徑共同參與的復雜病理過程，可能由于取材和吻合的機械性作用、局部血流動力學改變和炎癥反應等原因引起的內(nèi)皮細胞受損及凝血系統(tǒng)活化而誘發(fā)。中膜SMC的遷移和增殖是IH形成的核心環(huán)節(jié)和必要條件[5]。目前認為,任何細胞發(fā)生增殖均要經(jīng)過細胞周期。細胞周期分為以下不同的時相: G0期(靜止期) 、G1期(DNA 合成前期) ,S期(DNA 合成期) 、G2期(DNA 合成后期) 和M期 (有絲分裂期) 。多種細胞因子和生長因子影響著細胞周期進展,而細胞周期的每一個時相又受不同的細胞周期調節(jié)蛋白的調控。

對平滑肌細胞增殖的調控機制研究發(fā)現(xiàn),細胞增殖周期的完成依賴于CDK的表達和激活,它作為催化亞基與調節(jié)亞基周期蛋白 (Cyclins) 構成多種全酶來發(fā)揮作用。CDK 是細胞周期調控網(wǎng)絡的中心分子,有三條調節(jié)途徑：Cyclins 與其結合活化CDK ;CKIs 與其結合阻遏CDK活性;細胞因子磷酸化、去磷酸化CDK調控其活性。CDK是有磷酸化作用的激酶，受其調節(jié)亞基即Cyclin的活化。兩者形成Cyclin-CDK復合物，即具有磷酸化的活性。總之,大量增殖的外膜平滑肌細胞和遷移入內(nèi)膜下的VSMC 均表現(xiàn)出不同程度、多種細胞周期調節(jié)蛋白的表達,這些調節(jié)蛋白控制著VSMC 的增殖特性,與動脈硬化的形成有十分密切的關系,有待更深入的研究探討[6-11]。

本實驗所采用的大鼠自體靜脈移植模型是較為公認的整體動物模型，與臨床實踐中以自體靜脈為移植物的各種旁路轉流術相似。細胞周期中有兩個關鍵轉折點：一是G1期進入S期，稱為“起始點”，位于G1末期，此時DNA開始合成；二是G2期進入M期，稱為“進入點”，位于M期起始部位，此時細胞開始分裂。CDK表達及活性的調控是細胞周期調控的核心,其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期,具有啟動DNA 復制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用。檢測結果表明了CDK2、CDK4基因在移植靜脈早期表達就開始增加，且與移植后內(nèi)膜增生的病理過程一致，在7～14 d達到高峰。說明了CDK2、CDK4基因在移植靜脈內(nèi)膜增生的病理過程中可能起到了重要作用。細胞周期是增殖信號轉導的最終共同通路,進入細胞周期和細胞周期的推進是血管增殖性疾病中的關鍵事件。VSMC 進入增殖狀態(tài),不僅伴隨著細胞周期的推進,還伴隨著化學趨化因子和粘附分子的表達以及細胞外基質的調節(jié)。因此,以細胞周期為靶點,牢牢控制VSMC 增殖周期將有望防治再狹窄的發(fā)生和發(fā)展。CDK2、CDK4基因可能是有希望的靶基因。已經(jīng)有文獻報道在動脈球囊損傷模型中應用反義CDK2基因可以抑制內(nèi)膜增生。在G1期/S期CDK2、CDK4基因共同表達增加，也說明了細胞周期的推進和內(nèi)膜增生是多種基因相互作用的結果，多基因多環(huán)節(jié)的聯(lián)合基因治療可能是今后的研究方向。

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